牦牛小脑不同区域神经营养素-4及其受体的表达特征与定位研究

神经营养素-4(NT-4)及其神经营养性酪氨酸激酶受体2(NTRK2)在小脑神经元存活、生长以及功能方面发挥着重要作用。为探讨NT-4和NTRK2在牦牛高原低氧适应中的作用,本研究以高原牦牛(Bos grunniens)和平原黄牛(Bos taurus)小脑为研究对象,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹技术(WB)、苏木精-伊红染色(HE)和免疫组织化学(IHC)对NT-4和NTRK2在牦牛与黄牛小脑不同区域中的表达分布进行分析。qRT-PCR和WB结果表明,NT-4基因和蛋白在牦牛小脑半球皮质中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);NTRK2基因和蛋白在牦牛小脑蚓部皮质中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05)。与黄牛相比,牦牛NT-4蛋白在小脑各区域中的表达均显著高于黄牛(P<0.05);牦牛NTRK2蛋白在蚓部髓质和小脑半球髓质中的表达量低于黄牛或无差异,其余区域均显著高于黄牛(P<0.05)。IHC结果显示,NT-4和NTRK2蛋白阳性表达特征基本一致,皮质区主要分布于分子层的篮状细胞、浦肯野细胞层以及颗粒细胞层,而髓质区则散在分布于神经胶质细胞以及神经纤维中。由上述结果可知,NT-4和NTRK2在小脑各区域的表达差异可能与其参与脑组织生理功能以及适应高原低氧环境有关。在低氧环境下,NT-4和NTRK2通过上调激活相关通路以发挥内源性神经保护作用,进而保护脑组织免受低氧损伤。本研究结果可为探究牦牛脑组织低氧适应机制提供基础。

大熊猫神经营养素-4基因在大肠杆菌中的表达(英文)

本文通过PCR技术,直接从大熊猫基因组DNA上克隆得到其神经营养素-4的成熟肽编码序列,通过序列分析发现,该基因在进化上具有较高的保守性。将神经营养素-4成熟肽完整编码序列克隆至pGEX-4T-3表达载体,并经IPTG诱导在大肠杆菌中进行原核生物表达,获得了大熊猫重组蛋白神经营养素-4。重组表达蛋白经纯化后,进行大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞神经营养因子的活性鉴定,发现其能够诱导神经细胞分化产生突触,具有预期的生物学活性。对大熊猫神经营养素-4的基因工程研究,为大熊猫癫痫的基因治疗奠定了基础。

神经营养素-4在成年猴脑的分布

目的 :为探讨神经营养素 4(Neurotrophin 4,NT 4)在成年灵长类动物猴脑的分布及功能提供有用的形态学依据。方法 :免疫组织化学SP法。结果 :NT 4 IR(Neurotrophin 4immunoreactive)分布于大脑皮层Ⅲ Ⅴ层的部分神经元胞体及突起以及白质内少量的神经胶质细胞 ;小脑皮质及白质内的部分神经元 ;海马CA1、CA2 、CA3区的部分神经元 ;此外豆状核、尾状核、脑桥核、前庭神经核、薄、契束核、副神经核等可见散在阳性反应细胞及交织成网的纤维。结论 :NT 4 IR广泛地分布于猴脑的多种组织和细胞 。

神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。

人神经营养素-4成熟蛋白基因克隆

本研究的目的是克隆人神经营养素-4成熟蛋白基因(mhNT-4)并进行序列分析。应用PCR技术,以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,扩增出人神经营养素-4(hNT-4)成熟蛋白编码基因。将所得基因片段重组于pGEM-T Easy质粒,筛选得到含人mhNT-4基因的阳性克隆。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列。所得到的序列与国外文献所报道的结果(GenBank,M86528)完全相同。mhNT-4成熟蛋白基因的成功克隆,为研究其在原核细胞中的表达提供了有利条件。本文结果也提示不同人种间及不同个体间hNT-4成熟蛋白基因是相对保守的。

人神经营养素-4的克隆及其在原核细胞的表达

目的：体外扩增人神经营养素－4(NT-4)基因，经克隆后在原核细胞中表达并鉴定人重组NT-4，为研究其生物学特性及临床应用奠定基础。方法：以人类基因组DNA为模板，扩增NT-4成熟活性蛋白的DNA编码序列，将此DNA片段克隆到载体PBV220中，对重组质粒进行PCR筛选和限制性酶切分析，确定后将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α进行诱导表达。用抗NT-4抗体进行Western blot鉴定重组蛋白。结果：体外成功扩增NT-4基因，转染的大肠杆菌经诱导后表达出能被抗NT-4抗体识别的重组蛋白，其表达量为15%。结论：在原核细胞能成功表达NT-4。

神经营养素-4在成年猴脑中的分布特征及其与成体中枢神经系统的功能关系(英文)

背景:神经营养素-4(NT-4,Neurotrophin-4)在神经系统的发育和成体中均起重要作用,不仅对某些特定亚群神经元的存活、增殖、分化及轴突可塑性有一定的调节作用,而且对某些神经元的生存也是必需的。但这些资料大多来源于体外实验,其在体内的作用尚不十分清楚,NT-4在体内的分布也少见报道,在高等灵长类猴脑的研究尚未见报道。目的:为探讨NT-4在成年灵长类动物猴脑的分布及为进一步研究NT-4与成体中枢神经系统的功能关系提供了有用的形态学依据。设计:用PBS代替一抗的实验对照。地点和材料:实验在昆明医学院神经科学研究所实验室完成。动物来自中科院昆明动物研究所的成年雄性恒河猴(体质量平均6kg)7只。方法:采用氯氨酮肌肉注射麻醉,Zamboin’s液心脏灌注固定,取脑组织各部位行冷冻切片,厚25μm。免疫组织化学SP法,抗体为兔抗NT-4多克隆抗体。主要观察指标:光镜下于猴脑的不同部位观察NT-4-IR阳性物(呈棕色串珠状、丝状或颗粒状)。对照实验用0.05mol/LPBS代替一抗行免疫组化染色。结果:NT-4-IR(Neurotrophin-4immunoreactive)分布于大脑皮层Ⅲ～V层的部分神经元胞体及突起以及白质内少量的神经胶质细胞;小脑皮质及白质内的部分神经元;海马CA1、CA2、CA3区的部分神经元;此外豆状核、尾状核、脑桥核、前庭神?

人神经营养素-4基因的克隆及表达

目的通过基因工程的方法扩增人神经营养素-4(hNT-4)cDNA,在大肠杆菌中表达hNT-4,为研究hNT-4的生物学作用提供材料。方法以人胎脑RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hNT-4 cDNA,将其插入的质粒pGEM-T中。将经过序列分析确定的hNT-4 cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达载体pGEX-6p-1-NT-4,用SDS-PAGE法测定融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析,克隆的hNT-4 cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank,M86528)完全一致,并获得了高效表达hNT-4的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-4 cDNA,并在原核细胞中高效表达了hNT-4。

人神经营养素-4基因的扩增及序列分析

从人基因组 DNA获取神经营养素 - 4(neurotrophin- 4 ,NT- 4 )基因 ,并对该目的基因进行序列测定 ,本实验直接从人脑组织中提取基因组DNA,根据人神经营养素 - 4的 c DNA序列 ,设计一对寡核苷酸引物 ,采用 PCR,获得人 NT- 4基因 ,用DNA序列分析 NT- 4基因。结果 ,我们获取的人NT- 4基因与文献报道有五个碱基不同。我们认为 :直接采用 PCR来获取目的基因 ,出现碱基错配的可能性较大 ;测序仪器和实验条件对结果有一定影响关系。

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素4基因(NT 4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基βD 半乳糖苷(Isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni2+ NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94%的NT 4成熟蛋白的融合蛋白为进一步研究NT

神经营养素-4及其受体的研究进展

神经营养素-4(NT-4)作为神经营养素家族的新成员,与其他家族成员-神经生长因子(NGF),脑源性神经生长因子(BDNF),神经营养素-3(NT-3),神经营养素-5(NT-5),神经营养素-6(NT-6)一起对神经元的生存及发育起重要作用。近来的研究结果显示,它在基因结构,氨基酸序列,生理功能等方面与其他家族成员相比有进化的保守性,又有自己进化的特殊性。它在哺乳动物体内有广泛表达,通过低亲和力NGF受体(P75^(LNCFR)),高亲和力trkA受体,高亲和力trkB受体发挥作用。NT-4在神经退行性疾病中的临床应用价值也在研究中。

神经营养素-4研究进展

神经营养素-4(NT-4)能够促进多种神经元的存活,在神经系统发育、分化和损伤修复过程中具有重要作用。NT-4是NGF家族成员之一,它的受体和BDNF相同为TrkB。NT-4的神经营养作用为运动神经元疾病的临床治疗带来了新的希望。

神经营养素—4基因工程细胞的构建

构建了含有大鼠ＮＴ－４基因的双拷贝逆转病毒载体，用电穿孔方法转染ＰＡ３１７包装细胞，获得重组逆转录病毒，再用该病毒感染肌母细胞（Ｌ－６ＴＧ）筛选出表达最高的作为ＮＴ－４基因工程细胞，表达的ＮＴ－４蛋白经ＰＣ１２细胞检测具有神经营养活性，表达量为：５００Ｕ／（１０＾６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。

面神经损伤大鼠面神经核团中NT-4 mRNA蛋白质表达变化及意义

目的分析面神经损伤大鼠面神经核团中神经营养素-4(NT-4)mRNA及蛋白质表达变化及意义。方法选取50只Wistar大鼠,所有大鼠右侧制造面神经骨管内挤压伤模型,左侧作为自身对照。分别于处理后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天采用原位杂交及免疫组化检测大鼠面神经核团中NT-4mRNA表达细胞数情况,并采用计算机图像分析测定其灰度,NT-4蛋白表达样本进行γ计数。结果正常大鼠面神经核团有较少NT-4表达。面神经损伤大鼠面神经核团中的NT-4mRNA含量及NT-4蛋白表达均明显升高,高于正常大鼠。面神经损伤大鼠面神经核团中的NT-4mRNA含量及NT-4蛋白表达均于受损初期迅速增高,至损伤后14d达最高值,随后逐渐降低。结论面神经损伤可刺激大鼠面神经核团NT-4mRNA含量及NT-4蛋白的表达,其变化趋势为先迅速上升后逐渐下降,提示NT-4mRNA含量及NT-4蛋白表达对面神经损伤的恢复具有重要意义。

构建重组表达质粒pBV220/mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达

利用基因重组技术将 mhNT-4亚克隆到表达载体 pBV220,构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4,诱导表达 mhNT-4成熟蛋白,鉴定 mhNT-4的生物活性。将经鉴定的 pGEM-TEasy/mhNT-4克隆用限制性内切酶EcoRI,BamHI 消化,琼脂糖凝胶电泳回收片断。酶切原核高表达载体 pBV220,用限制性内切酶 EcoRI,BamHI 消化,琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体。用 T4DNA 连接酶连结两个回收片断,构建重组质粒 pBV220/mhNT-4。限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。经鉴定的重组质粒 pBV220/mhNT-4转染大肠杆菌 DH5α,温度诱导表达 mhNT-4蛋白。SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术分离表达的 mhNT-4蛋白。制备8～9d鸡胚,分离并培养背根神经节(DRG)细胞。分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白,培养鸡胚背根神经节 DRG细胞,检测 mhNT-4生物活性。重组表达质粒 pBV220/mhNT-4构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达、分离了 mhNT-4成熟蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出,对照组未见神经突起长出。mhNT-4成熟蛋白具有良好的生物活性。本研究为进一步开展 mhNT-4基因治疗青光眼提供了资料。

IL-31和他克莫司对Hacat细胞NT4表达的影响

目的:探讨白介素-31(interleukin-31,IL-31)、他克莫司对角质形成细胞神经营养素-4(neurotrophin-4,NT4)表达的影响。方法:培养人角质形成细胞株(Hacat细胞),采用不同浓度他克莫司作用24 h,噻唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖活性。IL-31、他克莫司单独或共同作用于Hacat细胞24 h后,采用real-time PCR法检测NT4 m RNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测12、24 h各组细胞上清液中NT4含量。结果:低浓度他克莫司(10、100)ng/ml对细胞活性无明显影响(P>0.05),高浓度(1 000 ng/ml)时细胞活性受到抑制(P=0.002)。IL-31作用Hacat细胞后,其NT4m RNA表达和上清中NT4含量均增加(P<0.05);100 ng/ml他克莫司作用24 h后他克莫司组和联合作用组细胞NT4 m RNA表达量和细胞上清中NT4含量均分别低于对照组和IL-31组(P<0.05)。结论:IL-31可促进角质形成细胞NT4表达,他克莫司可能通过降低角质形成细胞NT4表达水平而发挥其抗瘙痒作用。

丙酸睾酮对小鼠睾丸NT-3和NT-4表达的影响

以30日龄雄性小鼠为研究对象,用丙酸睾酮分别处理小鼠6,12,24 h后收集睾丸,提取睾丸总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量和Western-Blot方法探究了雄激素对睾丸中神经营养因子NT-3及NT-4表达的影响。荧光定量结果表明:丙酸睾酮处理小鼠,12 h组和24 h组NT-3及NT-4的表达显著升高,其他各组间无显著差异。Western-Blot结果与荧光定量结果一致。说明丙酸睾酮能够调节小鼠睾丸中NT-3和NT-4的表达。

丙烯腈对大鼠学习记忆能力及海马NT-3、NT-4和TLR4蛋白表达的影响

目的探讨丙烯腈(acrylonitrile,AN)对大鼠学习记忆能力、海马细胞增殖、神经相关蛋白的影响。方法将40只成年雄性SD大鼠按体重随机分为4组,每组10只,分别为对照(0 mg/kg)组及5、10、20 mg/kg AN染毒组,均灌胃染毒4周。染毒后以Morris水迷宫和避暗实验进行神经行为测试。测试后腹腔注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记海马组织中的神经增殖细胞,并在激光共聚焦显微镜下观察。以Western blot法检测海马组织中神经生长相关蛋白神经营养素-3(neurotrophin3,NT-3)、神经营养素-4(neurotrophin 4,NT-4)和Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)的表达情况。结果对照组大鼠发育正常、行动迅速,5、10 mg/kg AN染毒组大鼠行为基本正常,20 mg/kg AN染毒组大鼠活动明显减少、反应迟钝。4组大鼠在染毒过程中的体重变化无明显差异(P>0.05)。各染毒组大鼠的水迷宫实验潜伏期长于对照组,避暗实验潜伏期短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。10、20 mg/kg AN染毒组大鼠的海马细胞增殖率均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。10、20 mg/kgAN染毒组大鼠海马组织中的NT-3、TLR4蛋白表达均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),NT-4在各组中的表达无明显差异(P>0.05)。结论AN对大鼠学习记忆能力有明显影响,其机制可能是通过降低海马组织中TLR4和NT-3的表达来抑制神经细胞增殖,引起学习记忆功能障碍。

解剖学

髋关节神经支配的解剖学研究及其临床意义；外踝前血管外踝骨膜骨瓣移位术的应用解剖；Atlas钛缆固定上颈椎的应用解剖；吻合血管神经第1跖趾关节移植重建肘关节的解剖学基础；髌骨测量参数分析及其在髌骨假体设计中的意义；骨性蝶腭孔的应用解剖；梨状隐窝定位食管入口的解剖学基础；梨状肌上孔内血管损伤致臀内上部坏死的解剖学基础；心房动脉的形态特点及其临床意义；趾甲的活体解剖测量及其临床意义；入神经营养素-4成熟蛋白基因克隆；受体（N-20）在大鼠视神经损伤后视网膜的表达；人参银杏复方制剂对缺氧复氧后大鼠海马CA1区NOS表达的影响；大鼠束缚后脑内星形胶质细胞的反应；Kv3．1和Kv3．2钾离子通道蛋白在大鼠神经系统的分布；对大鼠下丘脑视上核nNOS和c-fos表达的影响；黄体酮对戊四唑致痫大鼠海马内GABA能神经元影响的形态学研究；大鼠孤束核内儿茶酚胺能神经元接受面口部深层组织伤害性信息并向臂旁核投射的形态学研究；神经营养素高亲和力受体在脊髓损伤大鼠运动神经末梢的分布；雌激素对卵巢摘除大鼠心内神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响；急性高眼压后大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶的表达变化。