推拿影响坐骨神经损伤大鼠行为学及神经营养素3、酪氨酸激酶受体C表达的研究

目的观察推拿对坐骨神经损伤大鼠行为学、神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)、酪氨酸激酶受体C(tyrosine receptor kinase C,TrkC)表达的影响,研究推拿修复坐骨神经损伤的机理。方法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、模型对照组、推拿组,采用大鼠坐骨神经夹持损伤法于右侧股骨中段下方夹持神经进行造模,7天后进行推拿干预,共20次。干预10次、20次后,分别通过坐骨神经功能指数(sciatic functional index,SFI)、斜板试验观察各组大鼠的行为学变化;再通过免疫组化法检测各组大鼠脊髓腹角NT-3、TrkC的表达情况,最后对各组数据进行统计分析。结果模型组和模型对照组大鼠行为学检测提示坐骨神经损伤大鼠的运动功能明显降低,在推拿干预后,斜板试验明显升高,神经功能恢复情况优于模型组和模型对照组(P<0.05);SFI有一定程度恢复,负值较模型组、模型对照组高,但差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、模型对照组及推拿组脊髓NT-3、TrkC表达与正常组相比差异均有统计学意义(P<0.05),推拿组NT-3表达与模型组相比差异也有统计学意义(P<0.05),推拿组更高。结论中医推拿可以改善神经损伤大鼠的行为学表现,可能是通过促进NT-3及其受体TrkC的表达,发挥抑制细胞凋亡,促神经元存活的作用,最终实现促进神经功能恢复,改善其运动功能。

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达(英文)

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径。基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径。目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况。设计:完全随机试验。单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供。用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15g/L。方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率。采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况。主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况。结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%。5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达。②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3mRNA的表达。结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。

电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化

背景:由于外源性神经干细胞的获取有限,且容易产生免疫排斥以及伦理问题等严重制约其向临床转化,因此如何激活内源性神经干细胞并促进其生长增殖、分化,成为近期科研工作者究的热点。目的:探讨电刺激联合神经营养素3对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖及向神经元分化的作用。方法:将96只SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、电刺激组、电刺激+神经营养素3组,每组24只。假手术组仅暴露脊髓,其他3组大鼠应用改良Allen法建立脊髓损伤模型,造模后给予相应措施进行干预。造模后7,14,21,28 d时,以BBB评分评价大鼠后肢运动功能,电生理学检查运动诱发电位潜伏期;造模后28 d取材,进行苏木精-伊红染色观察脊髓病理变化,免疫组化染色观察内源性神经干细胞的增殖和分化情况。实验方案经兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。结果与结论:①与假手术组相比,脊髓损伤组大鼠的BBB评分明显降低(P<0.01),脊髓组织可见大量炎症细胞浸润,并存在多个空洞;与脊髓损伤组相比,电刺激组、电刺激+神经营养素3组大鼠后肢功能开始逐渐恢复,电刺激+神经营养素3组BBB评分明显高于电刺激组(P<0.05),上述病理损伤变化明显改善;②脊髓损伤组7,14d及电刺激组大鼠7 d时双后肢运动诱发电位潜伏期均未测出,电刺激组、电刺激+神经营养素3组21,28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P<0.05),电刺激+神经营养素3组潜伏期缩短更显著(P<0.05);③BrdU和Nestin阳性细胞数、微管相关蛋白2的表达:电刺激+神经营养素3组>电刺激组>脊髓损伤组;胶质纤维酸性蛋白的表达:脊髓损伤组>电刺激组>电刺激+神经营养素3组。结果表明脊髓损伤大鼠经电刺激及神经营养素3干预后,促进内源性神经干细胞增殖和向神经元分化,病理损伤明显减轻,后肢运动功能显著改善。

痿症方联合嗅鞘细胞移植对脊髓慢性压迫损伤后神经营养素3表达的影响

背景:中药痉证方、痿证方具有促进神经营养因子分泌的作用已经诸多实验结果证实,而脊髓功能恢复与神经营养素3的表达与分泌有密切的关系。目的:实验拟观察痿症方联合嗅鞘细胞移植对脊髓慢性压迫损伤后神经营养素3的影响。设计、时间及地点:对照动物实验,细胞学观察,于2005-11/2007-03在上海中医药大学脊柱病研究所完成。材料:新生SD雄性大鼠10g采用酶消化法培养嗅鞘细胞。3月龄雄性SD大鼠以螺钉持续性压迫大鼠C4脊髓的方法建立脊髓慢性压迫动物模型。痿症方由上海中医药大学脊柱病研究所提供,成分为炙黄芪、党参、炒白术、当归。方法:造模1个月后分为:模型组,后路椎板减压,继续喂养2个月;DF12培养液组:注入等剂量DMEM/Ham's F-12培养基,继续喂养2个月。嗅鞘细胞组:嗅鞘细胞移植,按1μL/点在距离脊髓压迫区域上下0.5mm处取4点注射109L-1嗅鞘细胞,注入速度为1μL/min,继续喂养2个月。含药血清培养嗅鞘细胞组:进行经痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞移植,按1μL/点脊髓内注射109L-1嗅鞘细胞,注入速度为1μL/min,继续喂养2个月。中药灌胃组:痿症方中药连续灌胃1个月,继续喂养1个月。设立正常对照组。主要观察指标:应用ELISA抗原竞争法、PT-PCR方法检测各组大鼠神经营养素3蛋白及mRNA的变化。结果:与模型组、DF-12培养液组比较,痿症方和嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中神经营养素3蛋白及神经营养素3 mRNA表达均明显增加。痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞移植与单纯嗅鞘细胞移植相比,脊髓组织中神经营养素3蛋白及神经营养素3 mRNA表达增加明显。与单纯痿症方相比,痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞移植脊髓组织中神经营养素3增加不明显,差异不显著,神经营养素3 mRNA表达差异显著(P<0.01)。结论:痿症方和嗅鞘细胞移植均可促进脊髓组织中神经营养素3的表达,但痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞与单纯痿症方治疗相比,结果未能在体现出差异。

神经营养素3在面神经的转运研究

目的 探讨面神经再生微环境及神经营养素 3(NT 3)对神经细胞的作用。方法 将新西兰兔一侧面神经干横切断后置入硅胶再生室 ,再将13 1I NT 3或12 5I NT 3或13 1I 人血清白蛋白 (HSA)(10 μL/只 ,约 7 4MBq)注入再生室 ,取注入13 1I NT 3或13 1I HSA的兔分别在注药后不同时刻行头部冠状位平面显像 ,取注入12 5I NT 3兔的面神经干、脑干和对侧面神经干测定其转运率。另取置入再生室的兔同时在再生室注入 1mgNT 3或 5 4mgHSA和 7 4MBq13 1I NT 3后 ,不同时刻行头部冠状位平面显像。结果 注药后 4h有 4 0 5 %的12 5I NT 3转运到面神经干中 ,12h为最高峰 (2 7 0 4% ) ;8h有9 85 %转运至脑干 ,2 4h转运至脑干的量达 41 18% ,但13 1I HSA在面神经中无转运 ,且13 1I NT 3在面神经的转运受NT 3的明显抑制。结论 NT 3在面神经中存在受体介导逆行转运。

特发性脊柱侧凸患者椎旁肌中神经营养素3的表达及意义

目的:研究特发性脊柱侧凸(IS)患者椎旁肌组织中神经营养素3(Neurotrophin-3,NT-3)在核酸水平(mRNA)的表达情况。方法:随机选择19例IS患者,年龄12～19岁,平均14.3岁,Cobb角42°～80°(平均54°)。手术中取顶椎(T7～T10)凸侧、凹侧椎旁肌肉组织,采用半定量RT-PCR法检测NT-3 mRNA表达水平。取4例相同年龄段的椎间盘突出患者手术切口头端非病变部位椎旁肌肉组织作为对照。结果:对照组椎旁肌中NT-3的mRNA表达阳性率50%,相对表达量为0.0237±0.0158,IS组患者椎旁肌中表达阳性率63.16%,相对表达量为0.1213±0.0939,较对照组表达量增加(P=0.051)。9例Cobb角>50°的IS患者表达阳性率为44.44%,相对表达量0.0431±0.0359,和对照组无明显差异;10例Cobb角≤50°的IS患者中表达阳性率为80%,相对表达量为0.1604±0.0895,与对照组和Cobb角>50°的IS患者比较有明显增加(P<0.01)。结论:正常椎旁肌组织中NT-3在核酸水平微量表达,特发性脊柱侧凸患者椎旁肌组织中NT-3 mRNA表达增加,尤其在小角度IS患者中增加明显,提示IS患者中存在神经营养因子表达异常。

神经营养素3对大鼠急性脊髓损伤后Fas表达的影响

[目的]探讨神经营养素3(NT-3)对脊髓损伤保护作用的分子机制。[方法]105只SD大鼠随机分成3组:对照组(生理盐水组),实验组(NT3组),假手术组。用改良Allen'sWD法以30gcm致伤SD大鼠制作大鼠全瘫模型,经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4、8、12、24h、3、7d注入NT320μl(含NT-3200ng),对照组在相同时间点给予等容积生理盐水,假手术组只打开椎板后蛛网膜下腔置管,不致伤,不给药。采用免疫组织化学方法检测Fas蛋白在脊髓神经元的表达变化情况。[结果]假手术组中Fas蛋白弱阳性表达,对照组中Fas蛋白4h即出现强阳性表达,24h达高峰,实验组与对照组相比Fas蛋白表达明显减少(P<0.01)。[结论]NT-3能通过抑制Fas蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经元凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。

神经营养素3及其受体在哮喘大鼠肺组织中的表达

目的研究神经营养素3(NT-3)及其受体酪氨酸激酶C(TrkC)和p75神经营养素受体(p75NTR)在哮喘大鼠肺组织中的表达情况。方法将28只4～6周龄的SD大鼠随机分为分为哮喘组(n=16)(以卵蛋白致敏和激发建立大鼠哮喘模型)和正常对照组(n=12)。取两组大鼠的肺组织制作病理切片,HE染色后光学显微镜下观察支气管和肺组织的病理学特征。采用Real-Time PCR技术检测两组大鼠肺组织中NT-3、TrkC和p75NTR mRNA的表达,并分析三者之间的相关性。结果光学显微镜观察发现:哮喘组大鼠支气管壁周围有较多淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润,可见支气管气道上皮脱落、杯状细胞增生及黏液栓增多等变化;正常对照组大鼠支气管及肺泡结构未见明显异常。哮喘组大鼠肺组织中NT-3、TrkC和p75NTR mRNA的相对表达量均显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示:NT-3 mRNA与TrkC mRNA的表达、NT-3mRNA与p75NTR mRNA的表达以及TrkC mRNA与p75NTR mRNA的表达均呈正相关(r分别为0.89、0.90和0.82,均P<0.01)。结论致敏哮喘大鼠肺组织内NT-3 mRNA表达水平升高。NT-3通过上调TrkC和p75NTR mRNA的表达,增强NT-3的功能效应,三者共同参与了哮喘气道神经源性炎症的发生。

慢病毒介导人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达

背景:神经营养素3是目前发现的在脊髓损伤修复中作用最强的神经营养因子,它能有效促进再生轴突穿越胶质瘢痕组织,从而修复脊髓损伤。目的:构建含有人神经营养素3基因的重组慢病毒载体(LV-hNT3),观察转染后人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成。材料:取新生3d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用于许旺细胞的培养及鉴定;慢病毒三质粒系统pGC-E1-EGFP,pHelper1.0和pHelper2.0为上海吉凯基因化学技术有限公司产品。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coliDH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine2000将pGC-E1-hNT3-EGFP,pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,按照病毒感染复数=1,4,8,10,12加入预先混好重组病毒完全培养液2mL,通过增强型绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度。将慢病毒转染许旺细胞,以未经转染的许旺细胞和经空载的慢病毒转染的许旺细胞为对照组。主要观察指标:慢病毒转染许旺细胞后,检测转染效率,通过实时荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测人神经营养素3在许旺细胞中的表达。结果:实验中重组质粒的外源基因序列与GeneBank中的人神经营养素3阅读框架序列完全一致;浓缩后病毒滴度为5×107TU/L,LV-hNT3感染许旺细胞后,许旺细胞发出明亮的绿色荧光,当感染复数=10时转染效率最高达85%,实时荧光PCR检测表明人神经营养素3mRNA在人神经营养素3-许旺细胞中高效表达,而对照组中未表达,蛋白免疫印迹证实人神经营养素3在许旺细胞中表达。结论:实验构建的含有人神经营养素3基因的慢病毒载体能感染许旺细胞并且高效表达人神经营养素3。

人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定(英文)

背景:脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor,BDNF)和神经营养素3(Neurotrophines-3,NT-3)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。方法:BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体,随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论:DNA测序显示,提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段,经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的BDNF和NT-3双基因真核表达载体。

神经营养素3对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响

目的探讨神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)对大鼠急性脊髓损伤的治疗作用。方法实验于2005-01/06在解放军第三军医大学中心实验室完成。选择60只健康SD大鼠,随机分为3组:对照组(生理盐水组),实验组(NT-3组),假手术组(n=5);用改良Allen's法以30gcm致伤SD大鼠制作大鼠T8全瘫模型,实验组经蛛网膜下腔导管于术后即刻,4h,8h,12h,24h,3d,7d注入NT-320(lμ含NT-3 200ng),对照组在相同时间点给予等量生理盐水,假手术组只打开椎板后蛛网膜下腔置管,不致伤,不给药。各组动物分别于术后24h,3d,7d、14d行BBB评分和MEP检查。结果60只大鼠全部进入结果分析,①实验组在24h、3d、7d、14d较对照组BBB评分分值提高[0.22±0.43/0.70±0.48(P<0.05);3.2±2.39/8.01±2.05;9.30±1.49/14.32±2.11;12.80±0.92/18.40±1.08(P<0.01)],②实验组MEP的N1波潜伏期在24h、3d、7d、14d均较对照组明显缩短[80.90±7.49/49.9±2.44(P<0.01);54.05±8.52/40.55±4.72(P<0.05);43.10±1.53/33.65±2.78(P<0.01);38.45±3.98/22.25±2.84(P<0.01)]。结论神经营养素3能明显促进脊髓损伤后运动功能的恢复,对大鼠脊髓损伤有明显治疗作用。

明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料的构建及其生物相容性检测

目的构建明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料,并检测其生物相容性。方法混合明胶、壳聚糖溶液后加入微量神经营养素3,将混浊液注模成型后冷淋干燥制备明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料,利用扫描电子显微镜观察支架材料形态,液体代替法测算孔隙率。提取明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料浸提液,观察其对神经干细胞活性的影响及对全反式维甲酸预诱导的神经干细胞分化的影响,并采用膜片钳技术检测诱导分化前后细胞的电生理特性。结果明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料内径为(267.0±13.8)μm,孔隙率为90.0%。神经干细胞在支架材料上生长良好,在全反式维甲酸诱导下形态向神经元样细胞改变,并初步表现出神经元间突触连接的结构,且诱导分化的神经元样细胞初步具备神经元细胞的电生理特性。结论成功构建了明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料,其与神经干细胞之间的生物相容性良好。

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体。方法应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822bp和5.2kb片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3cDNA序列完全一致。结论成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3。

神经营养素3和受体在早期人胚脑发育中的定位表达

目的:了解在早期人胚脑的发育过程中,大脑神经元的增殖情况;了解神经营养素3(NT-3)和受体TrkC在人胚脑发育过程中的影响。方法:用6周龄的人胚进行免疫组织化学ABC法染色,以PCNA作为大脑神经元的增殖的指标,NT-3和受体作为了解影响人胚脑发育因素的指标。结果:在人胚胎早期发育阶段,PCNA免疫阳性反应物主要分布于人胚前脑的神经细胞核中,NT-3免疫阳性反应物主要分布于前脑脑室神经上皮层的胞质中和神经细胞的轴突中,其受体TrkC散在分布于人胚前脑神经细胞膜;发育过程中NT-3及其受体在脑室神经上皮层上呈现不同程度的免疫阳性反应。结论:NT-3及其受体TrkC在早期的人胚胎脑发育中呈现表达,提示NT-3可能诱导神经细胞增殖,并协同其它生长因子促进轴突的生长,保证神经元胞体的存活。

人神经营养素3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带人神经营养素3(hNT3)基因的重组慢病毒表达载体。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,将该质粒转化大肠杆菌DH5α,通过PCR、酶切、测序和对比验证hNT3,通过Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,经大量扩增后,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度。结果:克隆得到512 bp目的hNT3全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,hNT3基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现hNT3基因的表达,且病毒滴度为5×107TU/L。结论:成功构建表达人hNT3基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为基因转染的有效工具在将来神经损伤修复实验研究中得到应用。

神经营养素3在小儿哮喘中表达的临床意义

神经营养素3(NT-3)参与了神经系统的发育和功能发挥。最近研究发现它在呼吸系统疾病,尤其是哮喘的发病中也发挥重要作用。本课题采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测哮喘各组和正常对照组血清中NT-3的表达水平;用NT-3体外刺激正常人外周血单核细胞(PBMC),采用ELISA法检测培养上清中IL-6和TNFα的表达水平。结果显示,与对照组相比,在哮喘组血清中NT-3的表达水平明显增高;并且它在哮喘发作期和缓解期中的表达量也要高于正常组;另外,NT-3可以显著促进PBMC分泌IL-6和TNFα。以上结果提示,可以将NT-3在小儿哮喘患者血清中的表达水平作为诊断病变过程的标记物,并且NT-3在维持气道高反应性方面也起到一定作用。

神经营养素3和受体在人胚脊髓发育中的定位表达

目的了解神经营养素3(NT-3)和受体TrkC在人胚脊髓发育过程中的定位分布。方法用4、5、6周龄3个时段的人胚进行免疫组织化学ABC法染色以了解不同时段NT-3和受体在人胚脊髓发育中的定位表达和分布情况。结果在人胚胎脊髓发育的3个实验段,NT-3阳性颗粒主要分布于胞质,其受体TrkC主要分布于胞膜;发育过程中NT-3及其受体在室管膜层-套层-边缘层3条带上呈现不同程度的免疫阳性反应。结论NT-3及其受体TrkC在不同时期的人胚胎脊髓发育中进行表达,提示NT-3可能诱导神经干细胞分裂增殖,并协同其它生长因子促进轴突的生长,保证神经元胞体的存活。

神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化

目的研究神经营养素3(NT-3)对人牙囊细胞(h DFCs)成骨分化的影响。方法体外分离并培养h DFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对h DFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对h DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)m RNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况。结果波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明h DFCs为间充质细胞来源。NT-3对h DFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·m L-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN m RNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),NT-3质量浓度为100 ng·m L-1时BMP-2、OCN m RNA的相对表达量达到最高。当NT-3质量浓度为50、100 ng·m L-1时矿化结节数量最多。结论适宜质量浓度的NT-3能促进h DFCs的成骨分化。

腺病毒载体-人神经营养素3基因治疗豚鼠耳蜗神经元损伤

目的在建立卡因酸(kainic acid,KA)致豚鼠耳蜗兴奋性传入神经元损伤动物模型的基础上,观察腺病毒载体携带的人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在豚鼠耳蜗内的表达及对豚鼠耳蜗KA损伤后传入神经元的保护作用。方法20只健康白毛红目豚鼠随机分成3组。第1组(6只):经右耳蜗鼓阶一次性灌注KA(4 mmol/L,10μl),建立耳蜗兴奋性损伤动物模型,7 d后再经右鼓阶灌注腺病毒载体-人神经营养素3基因复合物(pAdeasy-NT3)10μl作为实验组(Ad-NT3组)。第2组(7只):经右耳鼓阶灌注KA(4 mmol/L,10μl)作为实验对照组(KA组)。第3组(7只):不做耳蜗灌注,作为空白对照组(Blank组)。Ad-NT3组和KA组均于KA处理后第20天处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞(传入神经元)的形态变化;空白对照组经相同的存活期后处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞形态,作为正常对照。结果Ad-NT3组灌注pAdeasy-NT3后第13天,应用免疫组化法可检测到耳蜗内NT-3表达明显,其强度大于KA组;而且Ad-NT 3组耳蜗螺旋神经节细胞减少的数量低于KA组(P<0.001)。结论①豚鼠耳蜗兴奋性损伤后第7天局部应用重组腺病毒pAdeasy-NT3仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。②对基因治疗而言,在KA造成螺旋神经节细胞不可逆损伤之前有一段宝贵的治疗时机。

神经营养素3修饰间充质干细胞对颅脑损伤大鼠神经保护作用

目的探讨神经营养素3(NT-3)修饰间充质干细胞对颅脑损伤大鼠的神经保护作用及其机制。方法随机选取1只SD大鼠分离骨髓间充质干细胞(MSCs),并构建NT-3过表达间充质干细胞。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测pLent-GFP-NC和pLent-GFP-NT-3细胞中NT-3蛋白的表达水平。60只SD大鼠成功制备颅脑损伤模型后,随机分为颅脑损伤组、间充质干细胞组、NT-3修饰间充质干细胞组。采用改良神经功能缺损评分法(mNSS)评价各组大鼠神经功能恢复情况。采用原位末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒测定大鼠脑组织中细胞凋亡。采用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9活性测定试剂盒(比色法)分析大鼠脑组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性,组间比较采用t检验。结果pLent-GFP-NT-3细胞(1.323±0.020)NT-3蛋白的表达水平明显高于pLent-GFP-NC细胞(0.357±0.018),差异有统计学意义(t=62.670,P<0.05)。NT-3修饰间充质干细胞组大鼠(7.700±0.733)神经功能评分明显低于颅脑损伤组(10.250±0.716)和间充质干细胞组(8.850±0.587),差异有统计学意义(t=11.130、5.478,P<0.05)。NT-3修饰间充质干细胞组大鼠[(16.808±1.280)%]脑组织细胞凋亡指数明显低于颅脑损伤组[(33.524±2.337)%]和间充质干细胞组[(24.930±2.230)%],差异有统计学意义(t=28.050、14.130,P<0.05)。NT-3修饰间充质干细胞组大鼠[(53.563±4.380)U/mg prot]脑组织中Caspase-3的活性明显低于颅脑损伤组[(148.943±10.937)U/mg prot]和间充质干细胞组[(90.860±5.312)U/mg prot],差异有统计学意义(t=36.210、24.230,P<0.05)。NT-3修饰间充质干细胞组[(43.800±4.835)U/mg prot]Caspase-8的活性明显低于颅脑损伤组[(124.530±8.603)U/mg prot]和间充质干细胞组[(79.262±5.749)U/mg prot],差异有统计学意义(t=36.570、21.110,P<0.05)。NT-3修饰间充质干细胞组[(34.575±3.241)U/mg prot]Caspase-9的活性明显低于颅脑损伤组[(88.640±4.178)U/mg prot]和间充质干细胞组[(65.624±5.119)U/mg prot],差异有统计学意义(t=45.730、22.920,P<0.05)。结论NT-3修饰间充质干细胞可显著减少颅脑损伤大鼠受损组织的细胞凋亡,起到改善并修复大鼠神经功能的作用。