p75神经营养蛋白受体基因敲除对小鼠面神经损伤后神经再生的影响

目的探讨p75神经营养蛋白受体(p75NTR)在面神经损伤后神经再生中的作用。方法对p75NTR基因敲除小鼠和野生型129sv小鼠的一侧面神经总干在神经出颅2mm处进行损伤,损伤后第2天,一部分小鼠在神经干损伤的近中侧注射霍乱毒素B(CTB)进行顺行示踪标记,损伤后3、7d,应用免疫组织化学方法对神经纤维再生轴突进行长度测定及记数分析。另一部分小鼠在面神经总干损伤后第4天切断神经,将切断的面神经断端置入含有FastBlue的聚氯乙烯单端小管中进行逆行示踪标记,荧光显微镜下对面神经核运动神经元进行计数分析。结果p75NTR基因敲除小鼠与野生型129sv小鼠相比较,再生的神经纤维轴突长度明显不足,二者间面神经核再生运动神经元数量差异有统计学意义(P<0.05)。再生轴突的免疫组织化学染色表明,p75NTR基因敲除小鼠再生的神经纤维轴突数量也明显降低(P<0.01)。结论p75NTR基因可以增强面神经的再生。

p75神经营养蛋白受体阳性舌鳞状细胞癌细胞的生物学特性研究

目的对流式细胞仪分选获得的p75神经营养蛋白受体(p75NTR)阳性舌鳞状细胞癌细胞进行生物学特性研究。方法通过流式细胞术检测舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR阳性细胞的表达。对流式细胞仪分选获取的p75NTR阳性细胞进行单克隆培养、四甲基偶氮唑盐比色法及划痕实验检测,以未分选细胞为对照,分析p75NTR阳性细胞的生物学特性。结果舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27中,p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1%和1.9%。与未分选的细胞相比,p75NTR阳性细胞的单克隆形成能力更高(Tca-8113细胞,P=0.024;Cal-27细胞,P=0.009);单克隆p75NTR阳性细胞再培养2周后,p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%(Tca-8113)和5.8%(Cal-27);p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强,且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。

基因重组神经营养蛋白-3的生物学活性

目的 :测定NT -3cDNA/CHO细胞表达的基因重组NT -3的生物学活性。方法 :体外培养 8日龄鸡胚背根神经节 (DRG) ,加入条件培养基 ,测量背根节神经突起生长的长度。结果 :NT -3cDNA/CHO细胞培养 4 8h后的无血清条件培养基 1∶2 4稀释后即能促进DRG神经突起的生长 ;随着其中NT -3浓度增加 ,神经突起长度也逐渐延长 ,有明显的量效关系 ;DRG培养 4 8h长出的神经突起与 2 4h相比 ,明显长而致密 ;NT -3生物活性的EC50 值为1 6.7ng/ml;NT -3浓度为 1 2 5ng/ml时 ,神经突起的长度达到最大值 ;NT -3cDNA/CHO细胞培养 72h的条件培养基中NT -3的活性高于培养 4 8h的条件培养基 ;NT -3单克隆抗体 3W 3的浓度为 0 .5μg/ml即能抑制NT -3的生物活性 ;抗体浓度为 1 μg/ml时 ,NT -3的生物活性降低一半。 结论 :基因重组NT

雪旺细胞无血清条件培养液中的神经营养蛋白活性

目的 进一步探测雪旺细胞无血清条件培养液中神经营养蛋白活性 .方法 收集成年大鼠坐骨神经雪旺细胞无血清条件培养液 (Schwanncellserum -freecondionedmedium ,SC -SFCM ) ,通过PM10超滤获取 >10Kd浓缩液 ,再经Disc -PAGE分离和Biotrap电洗脱 ,从SC -SFCM中分离出A、B、C、D四组蛋白带 ,选择其最佳活性浓度 ,四组蛋白带按照 7种不同组合加入脊髓前角神经元 (SAHN)培养液中 ,通过MTT法进行神经营养活性检测 .结果 含D蛋白带的各组 ,其OD值均显著高于对照组 p <0 .0 1) ,而不含D蛋白带的其它各组 ,其OD值与对照组比较无显著性差异 (p >0 .0 5 ) .结论 来自于SC

雪旺细胞浆神经营养蛋白高效液相分离纯化及其生物活性研究

目的 分离纯化雪旺细胞浆神经营养蛋白并研究其生物活性。方法 取 30 0只出生后 1～ 3天SD大鼠双侧坐骨神经 ,纯化培养 ,收集雪旺细胞 ,超声粉碎 ,超速离心 ,不同孔径分子筛滤膜 (PM10、30、5 0 )超滤浓缩 ,收集分子量 10～ 30 ku,30～ 5 0 ku和 >5 0 ku三种组份胞浆蛋白浓缩液 ,分别加入体外无血清培养的 E14SD胎鼠脊髓运动神经元培养液中 ,用 MTT酶标法检测证实 10～ 30 ku和 >5 0 ku两组份蛋白有神经营养活性。再通过Diol- 15 0高效液相分子层析进一步从雪旺细胞胞浆中纯化分离出分子量为 2 6 ku和 5 8ku两种胞浆蛋白 ,并对其神经生物活性进行研究。结果 2 6 ku和 5 8ku雪旺细胞胞浆蛋白能维持体外无血清培养的脊髓运动神经元存活 ,其最佳生物活性浓度为 2 0 ng/孔。结论 雪旺细胞胞浆内含有分子量为 2 6 ku和 5

雪旺氏细胞源神经营养蛋白的^(125)碘标记物制备与鉴定

雪旺氏细胞源神经营养蛋白（Ｓｃｈｗａｎｎ－ｃｅｌｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＣＤＮＴＰ）是从雪旺氏细胞中提取的一种神经营养蛋白，分子量为５４×１０３，尤其对运动神经元有较强的营养支持和促进其损伤后修复作用［１］。但ＳＣＤＮＴ...

雪旺细胞胞浆神经营养蛋白促进周围神经再生的实验

目的 研究雪旺细胞胞浆神经营养蛋白 (SDNF)对周围神经再生的影响。方法 选用 90只成年SD大鼠 ,在右侧坐骨神经造成长 10 m m缺损 ,用植入血管的变性骨骼肌桥接神经缺损。分成三组 ,每组 30只。分别将分子量为 2 6、5 8ku的 SDNF和生理盐水 (对照组 )于术中、术后 7及 14天注入肌桥的近段、中段和远段。术后均观察 6个月。术后 15天开始 ,每隔 15天走足印一次 ,测定坐骨神经功能指数。术后 1、3、6个月 ,每组取 10只大鼠行神经电生理检测、比目鱼肌收缩力测定和组织形态学观察。结果 分子量为 2 6、5 8ku的 SDNF两实验组坐骨神经功能恢复指数、神经电生理、比目鱼肌收缩力和形态学观察指标 ,与对照组比较有非常显著性差异 (P<0 .0 1)。结论 分子量为 2 6和 5 8ku的 SDNF有促进损伤的周围神经再生作用。

神经营养蛋白低亲和力受体p75^(NTR)的结合蛋白

神经营养蛋白通过酪氨酸激酶受体Trk和低亲和力受体p75NTR发挥其多种生理功能。通过蛋白质相互作用的研究技术已确认了十多个与p75NTR相互作用的蛋白质分子 ,它们在结构和功能上都存在显著差异 。

亚甲蓝通过脑源性神经营养因子/原肌球蛋白相关激酶B通路减轻脑缺血再灌注大鼠的认知功能障碍

目的研究亚甲蓝(MB)在缺血再灌注引起的认知功能障碍治疗中的作用及机制。方法2021年1月至2022年10月,以大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠为实验对象,MCAO术后立即腹腔注射亚甲蓝(10 mg/kg),运用改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS)评估大鼠的神经损伤程度,水迷宫试验评估大鼠的认知能力,尼氏染色观测海马CA1区神经元结构,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测脑源性神经营养因子(BDNF)/原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)蛋白表达水平。结果与缺血再灌注组相比,缺血再灌注后给予亚甲蓝的大鼠mNSS评分显著降低[24 h:(4.63±0.74)分;72 h:(3.5±1.07)分],认知能力显著提升[水迷宫潜伏期(14.58±2.90)s,穿越平台次数(7.25±1.67)次],梗死体积显著减少[(30.54±5.11)mm^(3)],海马CA1区神经元结构损伤减轻,神经元凋亡数量显著下降[(6.12±2.03)个],BDNF/TrkB蛋白表达量显著增加(BDNF:0.53±0.01;TrkB:0.65±0.08)。结论亚甲蓝可减轻脑缺血再灌注大鼠的认知功能障碍,且可能系通过BDNF/TrkB通路发挥了作用。

雪旺细胞分泌神经营养蛋白的提纯

目的：寻找出提纯神经营养蛋白的实用而有效的方法。方法：收集ＳＤ乳鼠周围神经的雪旺细胞无血清条件培养液，离心，将上清液超滤浓缩（ＰＭ１０）收集分子量大于１０ＫＤａ浓缩蛋白液，经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤获得三个蛋白峰，经生物活性检测，证明洗脱Ⅱ峰液生物活性最大。将冼脱Ⅱ峰液再经ＰＭ１０超滤膜浓缩收集浓缩蛋白液，分别用ＴＨＫ２４、ＴＴＫ２４微型过滤器去除大于１００ＫＤａ和小于３０ＫＤａ蛋白，过分子筛高效液相色谱柱。结果：得到４个主要蛋白峰，前三峰蛋白分子量均超过１５０ＫＤａ，第四峰分子量为６７ＫＤａ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和银染色法进一步证实该蛋白分子量为６７ＫＤａ，基本为单一蛋白带。结论：Ｓｅｐｈａｄｅｘ凝胶过滤、多次超滤和分子筛高效液相色谱技术综合应用是纯化雪旺细胞源神经营养蛋白较好的方法。

许旺细胞源神经营养蛋白的研究进展

外周神经损伤的修复是临床治疗的难题之一，尽管近年来采用了精细的显微外科技术及细胞外科技术较好地恢复了受损神经的连续性，但神经功能的恢复往往不能令人满意：迫使人们转向从神经再生的内在机制寻找解决途径：保护受损神经元免于死亡，促进神经再生，加快神经功能恢复。自20世纪50年代神经生长因子被发现以来，包括NGFs、CNGF、GDNF、MDNF等在内的多种神经营养因子相继被发现与神经元存活及轴突再生密切相关。由于这些生长因子从多方面揭示了神经再生过程的分子机制，从而成为近10年来神经研究领域的热点。

雪旺细胞胞浆神经营养蛋白的分离纯化和理化性质测定

目的：分离纯化雪旺细胞胞浆神经营养蛋白并测定其等电点。方法：培养收集新生１－３天ＳＤ乳鼠四肢神经雪旺细胞，超声粉碎，超速离心，取上清胞浆成份超滤浓缩，收集分子量＞１０ＫＤａ浓缩蛋白液，通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ离子交换层析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和Ｄｉｏｌ－１５０高压液相分子筛层析进行分离纯化，等电聚焦电泳测定纯化的活性蛋白质等电点和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其亚基分子量。结果：成功地分离纯化出一种活性蛋白质，分子量约５８ＫＤａ，等电点４．５５，结论：联合应用超滤浓缩、离子交换层析。

基因重组神经营养蛋白-3在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

建立了能表达基因重组NT 3的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系 ;通过Southernblot分析表明克隆细胞染色体中有明显的NT 3基因插入 ;用DotELISA和Westernblot实验证实了目的蛋白的表达及其分子量约为 1 4ku .利用EIA方法测定了阳性细胞株表达NT 3的量平均为 2 1 0 0ng/( 1 0 6细胞·48h) ;rNT 3可促进鸡E8背根神经节神经突起生长 ,其长度与rNT 3浓度有明显的量效关系 ;rNT 3的EC5 0 值为 1 6 .7ng/mL ;单克隆抗体 3W3可中和所表达的rNT 3的生物活性 .

雪旺细胞源神经营养蛋白的纯化及其体外生物活性的研究

目的：纯化和研究源于雪旺细胞质的运动神经营养因子。方法：２００条预损伤２周后的ＳＤ大白鼠坐骨神经，用酶消化结合差速粘附法纯化并收集其中的雪旺细胞；超声粉碎雪旺氏细胞，离心，收集上清液再经起滤，过高效液相分子柱，雪旺细胞上清液蛋白分为分子量分别为小于１０ＫＤ，２６ＫＤ，５０ＫＤ，７５ＫＤ，及大于２００ＫＤ五个组分，分别和胎鼠脊髓运动神经元联合培养２４小时，用ＭＴＴ法测定神经元活性。结果：２６ＫＤ，５０ＫＤ，和７５ＫＤ蛋白组分对脊髓运动神经元有维持成活的营养作用，结论：雪旺细胞可合成和分泌三种运动神经营养蛋白，分子量分别为２６ＫＤ，５０ＫＤ和７５ＫＤ。

三步法纯化雪旺细胞源神经营养蛋白

目的探索三步法纯化及获得雪旺细胞源神经营养蛋白的方法，为获得纯化蛋白进行单克隆抗体研究奠定基础。方法收集预损伤大鼠坐骨神经２００条，用酶消化结合差速粘附法纯化并收集其中雪旺细胞，将细胞超声粉碎、离心，收集上清液超滤，再经ｓｅｐｈａｄｅｘＧ１００层析，得到两个主峰，分段收集，将其中活性部分过高效液相色谱柱。结果得到三个主峰，相对分子质量分别为６８×１０３、５４×１０３和３０×１０３，用ＭＴＴ法测定生物活性，５４×１０３蛋白生物活性最大，经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实基本为单一蛋白带。结论应用三步法同时各步采用合适方案是纯化雪旺细胞源神经营养蛋白的较好方法。

慢病毒介导沉默P75神经营养蛋白受体联合NGF过表达转染BMSCs复合脱钙骨基质异位成骨的实验研究

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代。取第3代BMSCs,分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因(B组)、NGF过表达基因(C组)、沉默P75NTR和NGF过表达双基因(D组)转染,以未转染细胞作为对照(A组)。转染7 d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8 d细胞的活性;Western blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况。将上述4组转染后BMSCs分别与DBM共培养制备组织工程骨后,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达。结果转染7 d A组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70%左右。Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中D组上升最明显,3~8 d细胞活性明显高于A组(P<0.05)。倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs能与DBM形成良好黏附。皮下异位成骨实验中,HE染色示术后4、8周,D组比其余3组有更多的骨组织形成。ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN mRNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论沉默P75NTR联合NGF过表达双基因共转染BMSCs复合DBM构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生。

帕金森病患者血清脑源性神经营养因子前体蛋白水平与病情严重程度及认知障碍相关性研究

目的探讨帕金森病(PD)患者血清脑源性神经营养因子前体蛋白(pro-BDNF)水平,分析其与病情严重程度、认知障碍的关系。方法选取海南省干部疗养院(海南省老年病医院)自2017年7月至2019年7月收治的110例PD患者为PD组,选取同期于我院体检的89例健康者为健康组。两组均采血检测血清pro-BDNF水平,采用蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评估认知功能。根据Hoehn-Yahr(H-Y)分期将PD患者分为1期组(n=38)、2~3期组(n=51)、4~5期组(n=21),比较3组血清pro-BDNF水平及MoCA评分。根据MoCA评分将PD患者分为认知障碍组(n=46)与非障碍组(n=64),比较两组血清pro-BDNF水平、H-Y分期。采用Pearson线性相关分析血清pro-BDNF水平与H-Y分期、MoCA评分的相关性。结果PD组血清pro-BDNF水平高于健康组,MoCA各维度评分及总分均低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。2~3期组、4~5期组血清pro-BDNF水平高于1期组,且4~5期组高于2~3期组,差异有统计学意义(P<0.05)。2~3期组、4~5期组MoCA各维度评分及总分低于1期组,且4~5期组低于2~3期组,差异有统计学意义(P<0.05)。认知障碍组血清pro-BDNF水平、H-Y分期高于非障碍组,差异有统计学意义(P<0.05)。经Pearson线性相关分析显示,血清pro-BDNF水平与H-Y分期呈正相关,与视空间与执行功能、命名、注意力、语言、延迟回忆、定向力评分及MoCA总分呈负相关(P<0.05);血清pro-BDNF水平与抽象评分无相关性(P>0.05)。结论pro-BDNF在PD患者血清中呈高水平表达,与患者的H-Y分期、MoCA评分均有相关性,可能成为临床评估PD进展的重要指标。

神经营养因子前体蛋白功能的研究进展

神经营养因子是一组在结构与功能上具有相关性的多肽性因子,它们通过前体蛋白的切割成为具有特定功能的成熟蛋白,为不同的神经细胞亚群提供营养支持,在中枢神经系统和周围神经系统的发育分化及病理生理中起着重要的作用。以前认为神经营养因子的前体不具有生理功能,最近的研究则表明,神经营养因子前体蛋白具有不同于神经营养因子的功能。研究发现,神经营养因子前体,至少神经生长因子和脑源性神经营养因子的前体大量存在于细胞外,它们通过与p75NTR和sortilin受体组成三聚体诱导神经细胞的凋亡。这一机制可能与神经发育时调节神经细胞的比例,神经损伤后神经细胞的死亡以及某些人类疾病的发生有密切联系。此外,神经营养因子前体还可能具有其他未知的新功能,对神经营养因子前体功能的深入研究将使人们对神经系统的发生、发育及神经系统疾病的发病机制有更加深入的了解,并有助于神经系统疾病新药物、新疗法的开发与研究。

钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子在胃癌中的表达及临床意义研究

目的研究分析两个因子在胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达变化,为临床早期诊断胃癌、评价患者预后提供参考。方法采用免疫组织化学法检测65例胃癌中央组织及癌旁正常组织和40例正常胃粘膜组织上皮中钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子的表达,并分析比较两个因子的表达分别与年龄、性别、肿瘤直径、分化水平、淋巴结转移、lauren分型、TNM分期、CEA、CA19-9、CA72-4、Hp的关系及两个因子表达的关系,分析临床意义。结果 (1)E-cad在胃癌中央组织组的表达率低于在正常胃粘膜组织上皮组和癌旁正常组织组的表达率,BDNF在胃癌中央组织组的表达率高于正常胃粘膜组织上皮组和癌旁正常组织组表达率。(2)E-cad的表达与淋巴结转移、分化水平及TNM分期有关,与直径、年龄和性别无关。BDNF表达与肿瘤直径、淋巴结转移、癌分化水平及TNM分期有关,与年龄和性别无关。(3)E-cad、BDNF与Lauren分型有关。(4)E-cad、BDNF的表达与CA19-9、CA72-4、CEA无关。(5)E-cad、BDNF的表达与Hp感染有关。(6)E-cad与BDNF的表达无关,可作为独立的影响胃癌因子。结论(1)钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子的表达与胃癌发生发展有关。(2)钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子存在潜在机制/通路拮抗另一因子,影响胃癌转移、浸润过程。

变应性鼻炎患者外周血中神经营养因子mRNA的表达

目的检测变应性鼻炎患者外周血中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)mRNA的表达水平,并分析基因表达与鼻炎病情严重程度的关系。方法采用成组对照试验,抽提变应性鼻炎患者外周血总RNA,以正常成人为对照组。使用实时定量RT-PCR检测NGF、BDNF、NT-3mRNA的表达水平,2-ΔΔCt法计算实验组基因表达的变化倍数。结果相较于正常成人,变应性鼻炎患者的外周血中NGF、BDNF、NT-3mRNA的2-ΔΔCt值依次为2.4368、4.4588、1.7818;NT-3mRNA表达的2-ΔΔCt值随着鼻炎严重程度加重呈递增趋势。结论相较于正常成人,变应性鼻炎患者外周血中NGF、BDNF、NT-3mRNA的表达量上调,可能与变应性鼻炎发病有关;NT-3可作为评价变应性鼻炎严重程度的分子生物学指标。