神经酰胺合成酶3通过SMAD6基因影响肝细胞癌的侵袭和转移

目的:由于缺乏早期诊断和有效治疗,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者预后较差。因此迫切需要更好地了解HCC相关的分子机制,并确定早期诊断和治疗的有效靶点。本研究旨在探讨神经酰胺合成酶3(ceramide synthase 3,CerS3)在HCC中的表达及其生物学作用。方法:收集深圳市人民医院159例HCC接受根治性切除术患者的临床标本,包括HCC组织和邻近非肿瘤组织。采用免疫组织化学染色、蛋白印迹法和real-time PCR检测CerS3在HCC组织和邻近非肿瘤组织中的表达。体外实验中,将Hep3B细胞分为载体对照组和CerS3载体组,并分别用含有cDNA对照或CerS3 cDNA的反转录病毒载体转染细胞;将HCC LM3细胞分为shRNA对照组或CerS3 shRNA组,并分别用含有shRNA对照或CerS3 shRNA慢病毒载体转染细胞。分别采用MTT、EdU、Transwell和划痕试验测定细胞的增殖、迁移和侵袭,并进行RNA测序以确定CerS3的下游信号。结果:与相应的相邻非肿瘤组织相比,HCC组织中CerS3 mRNA和蛋白质水平均升高(均P<0.05)。Cox回归生存模型的单变量和多变量分析显示:静脉浸润(95%CI:1.8~9.2,P<0.01)、TNM分期(95%CI:2.3~5.2,P<0.05)、组织学分级差(95%CI:1.4~6.8,P<0.05)和CerS3(95%CI:1.5~3.9,P<0.05)与HCC患者总生存率显著相关。此外,与肿瘤组织中CerS3低表达患者相比,CerS3高表达患者的总生存率显著缩短(P<0.05)。与载体对照组相比,CerS3载体组Hep3B细胞活力、EdU阳性细胞数、迁移和侵袭细胞数均显著增加(均P<0.05)。与shRNA对照组相比,CerS3 shRNA组HCC LM3细胞活力、EdU阳性细胞数、迁移和侵袭细胞数均显著降低(均P<0.05)。RNA测序将母体抗生物皮肤生长因子同源物6(small mothers against decapentaplegic family member 6,SMAD6)基因鉴定为促进HCC转移的致癌基因。结论:CerS3的过度表达与不良临床特征和不良预后密切相关。CerS3在功能上可通过激活SMAD6基因参与肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。

6尿素神经酰胺抑制Wnt信号通路抑制结肠癌细胞增殖的研究

目的探讨6尿素神经酰胺对结肠癌细胞增殖的影响及其分子生物学机制。方法体外培养人源低分化结肠癌细胞系RKO细胞(购自美国典型菌种保藏中心),经过5(低剂量组)、10(中剂量组)、20μmol/L(高剂量组)不同浓度的6尿素神经酰胺分别诱导处理RKO细胞24、48、72 h,同时设立空白对照组。分别利用噻唑蓝(MTT)、流式细胞术检测各组细胞相对生存率、凋亡率;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞中Wnt信号通路相关蛋白表达情况。采用SPSS 23.0软件中方差分析和t检验进行数据统计学分析。结果随着药物浓度升高和药物作用时间延长,RKO细胞相对生存率[空白组为100%、100%、100%;低剂量组为(85.35±12.52)%、(72.95±10.11)%、(53.55±8.56)%;中剂量组为(70.75±10.74)%、(56.33±7.05)%、(40.05±10.11)%;高剂量组为(50.55±7.42)%、(35.58±5.75)%、(20.98±7.11)%]显著降低(F=23.803,P<0.05),凋亡率显著升高(F=18.284,P<0.05),差异均有统计学意义;各组细胞在相应条件下培养24 h后总蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3(GSK3β)蛋白表达量差异无统计学意义(F=1.093,P>0.05),但随着药物浓度增加磷酸化Akt、磷酸化GSK3β和β-连环蛋白(β-catenin)表达量显著降低(F=6.824,P<0.05),差异有统计学意义。结论6尿素神经酰胺可以通过抑制Akt磷酸化,从而抑制GSK3β磷酸化,减少β-catenin表达,抑制结肠癌细胞增殖。

miR-139-5p对人肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨微小RNA(miRNA)-139-5p在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖、侵袭的影响和潜在的分子机制。方法 采用生物信息学方法,从GEO数据库中下载GSE36915数据集,进行差异miRNA分析,结合TCGA-LICH数据集中的生存数据,筛选与预后显著相关的miRNA。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139-5p在肝癌及其癌旁组织中的表达。利用CCK-8实验、Transwell实验观察miR-139-5p对人肝癌细胞SK-Hep-1和SMMC-7721的表型变化。采用高通量测序检测过表达miR-139-5p的SK-Hep-1细胞中基因表达的变化,确定miR-139-5p调控的潜在的信号通路和靶基因,并采用免疫印迹实验和报告基因实验进行验证。结果 通过对GSE36915数据集进行分析,共鉴定到50个显著差异表达的miRNA。结合TCGA-LICH数据集中的生存数据,发现在差异最显著的20个miRNA中,miR-15b-3p、miR-1180-3p、miR-139-5p、miR-139-3p与预后显著相关,最终确定miR-139-5p为进一步研究对象。miR-139-5p在100对肝癌组织的相对表达水平显著低于对应癌旁组织[(0.50±0.33) vs (1.02±0.43),P<0.001],且低水平的miR-139-5p肝癌患者中位生存期较短(25.5个月vs 43.0个月,P<0.01)。人肝癌细胞系SK-Hep-1和SMMC-7721中过表达miR-139-5p,可以显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。高通量测序分析发现,在过表达miR-139-5p的SK-Hep-1细胞中,差异表达基因显著富集在Sphingolipid信号通路。经免疫印迹实验和报告基因实验验证,Sphingolipid信号通路中神经酰胺合成酶6(ceramide synthase 6,CerS6)是miR-139-5p的新的靶点。结论 miR-139-5p在肝癌组织中表达减少,导致其下游靶基因CerS6过量表达,从而激活Sphingolipid信号通路,促进肝癌发生发展。本研究提示miR-139-5p可以作为肝癌治疗的新的靶点。