葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法运用Alamar BlueTM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果(1)阿霉素(ADR)对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱(VCR)对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。(2)K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。

新型寡核苷酸对乳腺癌细胞葡萄糖神经酰胺合酶与P-糖蛋白表达的影响

目的:观察新型反义寡核苷酸MBO-asGCS对乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)与P-糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:实时PCR检测MBO-asGCS处理的耐药型乳腺癌细胞MCF-7-AdrR,蛋白质印迹分析MCF-7-AdrR及其转化细胞中GCS与P-gp的蛋白表达,TUNEL法检测MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中的细胞凋亡情况。结果:在耐药株和GCS过表达的MCF-7-AdrR/GCS中GCS和P-糖蛋白表达特征性上升,而在asGCS转化细胞MCF-7-AdrR/asGCS中GCS和P-糖蛋白表达明显下降;MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中GCS基因表达下调63.6%,凋亡细胞显著增加(P<0.01)。结论:乳腺癌细胞的耐药机制中可能存在GCS和P-糖蛋白的某种关联,升高的GCS可促进神经酰胺的代谢并增强P-糖蛋白的表达,产生耐药现象,反义寡核苷酸可抑制GCS表达,下调P-糖蛋白并促进凋亡。

葡萄糖神经酰胺合酶及其基因在乳房肿瘤中的表达

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylceram ide synthase,GCS)及其基因在不同的良恶性乳房肿瘤中的表达情况,以探讨GCS与乳房肿瘤的关系。方法采用免疫荧光抗体染色技术检测临床良恶性乳房肿瘤组织切片中的GCS含量;并通过RT-PCR的方法分析不同乳房肿瘤组织中GCS基因的表达情况。结果恶性肿瘤组织切片中GCS的表达明显强于良性肿瘤组织:且以β-actin为内标,恶性肿瘤组织GCS基因的相对表达量与良性组织相比亦存在显著性差异(P<0.05)。结论乳房癌组织中GCS的含量显著增高,其可能与恶性肿瘤细胞的无限制生长及产生耐药性相关。

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylcerarnide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV_(200)及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV_(200)经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV_(200)细胞耐药逆转后GCS及mdrl基因的表达。结果 KBV_(200)细胞GCS和mdrl基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdrl基因表达为阴性。5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,25 μmol/L时抑制强度最大;10 μmol/L异搏定即可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,15 μmol/L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdrl基因的表达,KBV_(200)经25μmol/L DL-PPMP作用48h后细胞内mdrl表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和marl基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdrl基因表达,逆转KBV_(200)对长春新碱的耐药。KBV_(200)GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。

神经酰胺合酶-神经酰胺通路在青蒿琥酯抑制肝纤维化中的作用

目的:探讨神经酰胺通路在青蒿琥酯(Art)抑制肝纤维化过程中的作用。方法:将肝星状细胞(LX-2)分为细胞对照组、Art 350μmol/L组、神经酰胺合酶阻断剂(FB1)6μmol/L组及FB16μmol/L+Art 350μmol/L合用组。每组7个复孔,作用24 h后,收集细胞及上清液进行检测。Western blot法测定神经酰胺合酶2(LASS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)、Caspase-3蛋白的表达,HPLC-FLD法对神经酰胺(Cer)的含量进行测定,MTT法检测LX-2的增殖情况,酶消化法检测羟脯氨酸(Hyp)的含量。结果:与细胞对照组比较,Art处理组神经酰胺合酶的蛋白表达、神经酰胺含量显著增加、LX-2细胞的增殖明显抑制、PPAR-γ和Caspase-3蛋白表达上调、羟脯氨酸分泌抑制(P<0.05);FB1处理组神经酰胺合酶的蛋白表达和神经酰胺含量显著降低、LX-2细胞增殖显著增加、PPAR-γ和Caspase-3蛋白表达下调、羟脯氨酸分泌增加(P<0.05);与Art单用组比较,两药合用可显著降低Art对神经酰胺合酶蛋白的表达和神经酰胺含量升高的作用,减弱Art对LX-2细胞增殖、PPAR-γ、Caspase-3蛋白表达及羟脯氨酸分泌的作用(P<0.05)。结论:青蒿琥酯可通过神经酰胺合酶-神经酰胺通路增加细胞中神经酰胺水平,发挥抑制肝纤维化的作用。

神经酰胺及代谢关键酶与肿瘤的多药耐药

多药耐药(multidrug resistence,MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因,多年来学者一直致力于多药耐药机制的研究。神经酰胺作为细胞凋亡的第二信使,参与多种细胞凋亡,它与凋亡相关因子bcl-2、NF-κB的关系一直是研究的重点。葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)可催化神经酰胺糖基化使其转变为葡萄糖神经酰胺,许多研究证明GCS与MDR表型有关。

环孢素A联合苯基棕榈酰胺吗啡丙醇对K562/AO2细胞GCS基因表达的影响及对逆转多药耐药

目的研究环孢素A(CsA)和苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)联合应用对人白血病多药耐药细胞株K562/AO2的葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因表达的影响及对白血病多药耐药的逆转作用,探索逆转白血病细胞耐药的策略。方法应用Alamar BlueTM多功能细胞染色法测定阿霉素(ADR)对K562和K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50)及判断CsA的非细胞毒性剂量;采用RT-PCR法检测GCS基因和mdr1基因的mRNA表达。结果CsA浓度低于4.5μg/ml对K562/AO2细胞无细胞毒性。ADR对K562和K562/AO2细胞的IC50分别为(0.84±0.04)μg/ml和(89.24±1.27)μg/ml;当1μg/ml CsA和25μmol/L PPMP单用或联合作用于K562/AO2细胞时,ADR的IC50分别为(7.81±0.74)(、17.49±0.53)(、2.82±0.07)μg/ml;而低浓度CsA(0.01μg/ml)和PPMP(10μmol/l)联合作用时IC50为(16.08±1.25)μg/ml。CsA联合PPMP可明显降低GCS基因的mRNA表达,低浓度CsA和PPMP联用也有此作用。结论CsA联合PPMP可通过抑制K562/AO2细胞的GCS基因mRNA表达有效逆转其耐药,低浓度CsA联合PPMP在逆转其耐药的同时降低了细胞毒性。

新型荧光薄层层析-分光光度计测定细胞内GCS酶活性

目的:通过建立一种新型的荧光薄层层析-分光光度法,精确而直接测定细胞内葡萄糖神经酰胺合酶GCS的活性,以评价其对耐药性肿瘤细胞的作用。方法:加入不同剂量的含荧光的NBD-C6-Ceramide,运用荧光薄层层析-分光光度法测定不同反应时间下人乳腺癌细胞MCF-7-AdrR中,葡萄糖神经酰胺(glucosylxeramide,GlcCer)和神经酰胺(ceramide,Cer)含量,计算两者的比值大小反映GCS酶活性情况,放射性酶学测定作为对照。Western-blot及免疫荧光分析MCF-7-AdrR及其转化细胞(MCF-7-adrR/GCS及MCF-7-adrR/asGCS)中GCS与P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表达关系。结果:研究表明5μmol/L NBD-Cer是细胞内神经酰胺糖基化作用的最佳浓度,糖基化作用随时间延长而增强,此方法精确测定MCF-7-AdrR各细胞及其它耐药型细胞中的GCS酶活性,MCF-7-adrR与MCF-7-adrR/GCS较药物敏感组MCF-7的糖基化作用(GC/Cer)明显增强(P均<0.01),而在MCF-7-adrR/asGCS中糖基化作用急剧下降(P<0.01)。放射性酶学测定结果与之相符。Western-blot及免疫荧光显示GCS表达与耐药标志物P-gp表达在MCF-7-AdrR各细胞中呈明显相关。结论:不同于传统的同位素酶学测定,这种新型荧光薄层层析-分光光度法,是测定细胞内神经酰胺糖基化作用的一种简单易行、重复性好的实验方法,为进一步应用于耐药性肿瘤的体内实验奠定基础。

多药耐药白血病细胞中GCS基因高表达及其意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因在细胞株K562/AO2和K562中的表达与白血病多药耐药(MDR)的关系。方法RT-PCR技术检测K562/AO2及K562细胞株的GCS和Bcl-2基因的表达;ELISA法检测两细胞株中Bcl-2及Caspase-3的表达;AlamarBlueTM细胞染色法分析K562/AO2细胞经苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)处理后多药耐药性的变化。结果K562/AO2细胞的GCS基因、Bcl-2基因和Bcl-2蛋白表达明显强于K562细胞(P<0.01),Caspase-3则相反(P<0.05)。K562/AO2细胞经25μmol/LPPMP处理后,GCS基因表达抑制,阿霉素(ADR)对其半数抑制浓度(IC50)明显降低。结论GCS基因可能在白血病MDR形成过程中起着重要作用,其机制可能为细胞凋亡相关基因的表达异常。PPMP通过抑制GCS活性有效逆转K562/AO2细胞的多药耐药性。

人源CerS2重组腺病毒构建及其对肝癌细胞HepG2细胞周期的作用

目的探讨神经酰胺合酶2(CerS2)过表达对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响及可能机制。方法化学合成人源CerS2基因CDS区并构建重组穿梭质粒pDC315-CerS2-绿色荧光蛋白(GFP),采用Admax系统将成功构建的CerS2重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP实现重组,并进行扩增、纯化及滴度测定。将正确构建的Adv-CerS2-GFP重组腺病毒与空载分别感染肝癌细胞HepG2(即对照组、空载组、实验组),激光共聚焦显微镜定位CerS2-GFP融合蛋白的表达,流式细胞术PI法检测各组细胞周期的分布;RT-qPCR、Western blot法检测各组细胞CerS2、p27mRNA及蛋白表达水平。结果经测序分析验证重组腺病毒构建成功。HepG2实验组CerS2、p27mRNA、蛋白相对表达水平较对照组、空载组明显增加(P<0.01)。对照组与空载组细胞周期时相分布差异无统计学意义(P>0.05),实验组细胞较对照组、空载组G_0/G_1期百分比明显增加(P<0.01);G_2/M、S期明显减少(P<0.01)。结论成功构建人源CerS2重组腺病毒且过表达的CerS2导致肝癌细胞HepG2细胞周期G_0/G_1期阻滞,其机制可能是通过上调p27从而抑制肝癌细胞的生长与增殖。

GCS和MDR-1基因在CML中的表达及意义

目的观察慢性粒细胞白血病(CML)患者葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)和多药耐药1(MDR-1)基因的表达变化及其意义。方法建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GCS、MDR-1和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的方法,检测CML初发组25例和急变组25例患者外周血GCS、MDR-1基因表达水平,以GAPDH为内参基因,两组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法。结果外周血GCS水平CML急变组较初发组显著增高(4.84倍,P<0.01),MDR-1表达CML急变组9例阳性(36%),CML初发组均为阴性。结论GCS和MDR-1基因高表达在CML急变患者的多药耐药中起着重要作用,其水平检测可为CML急变预后判断的新指标。