拟南芥(Arabidopsis thaliana)miR396分子对类神经酰胺酶基因表达的负调控

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)mi R396小分子为研究对象,分别克隆到了mi R396小分子的两个前体(MIR396a,MIR396b),得到转基因植株后,通过Microarray分析、Northern杂交以及遗传学分析的方法探讨了mi R396与拟南芥类神经酰胺酶基因的关系.对mi R396高表达转基因植株进行Microarray分析的结果表明,拟南芥类神经酰胺酶基因(Atceramidase-like1,Atce-ramidase-like2)在mi R396高表达转基因植株中的表达与空载体转基因植株相比下降2倍以上,而4-alpha-乳糖基神经酰胺半乳糖转移酶则增加2倍以上.Northern杂交结果进一步验证了Microar-ray分析的结果,即在mi R396高表达转基因植株中,拟南芥类神经酰胺酶基因的成员Atceramid-ase-like1和Atceramidase-like2表达水平均显著降低(分别减少6.8倍和2倍以上),而Atceramid-ase-like3的表达水平在35S:MIR396a转基因植株叶中有所下降,在35S:MIR396b转基因植株叶中变化不明显.相反地,在35S:MIR396a和35S:MIR396b转基因植株叶中,mi R396表达水平分别比空载体转基因植株增加2倍以上.上述研究结果说明拟南芥mi R396能有效地负调控Ceramidase-like1和Ceramidase-like2等基因的表达水平.

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法运用Alamar BlueTM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果(1)阿霉素(ADR)对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱(VCR)对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。(2)K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylcerarnide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV_(200)及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV_(200)经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV_(200)细胞耐药逆转后GCS及mdrl基因的表达。结果 KBV_(200)细胞GCS和mdrl基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdrl基因表达为阴性。5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,25 μmol/L时抑制强度最大;10 μmol/L异搏定即可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,15 μmol/L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdrl基因的表达,KBV_(200)经25μmol/L DL-PPMP作用48h后细胞内mdrl表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和marl基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdrl基因表达,逆转KBV_(200)对长春新碱的耐药。KBV_(200)GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。

环孢素A联合苯基棕榈酰胺吗啡丙醇对K562/AO2细胞GCS基因表达的影响及对逆转多药耐药

目的研究环孢素A(CsA)和苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)联合应用对人白血病多药耐药细胞株K562/AO2的葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因表达的影响及对白血病多药耐药的逆转作用,探索逆转白血病细胞耐药的策略。方法应用Alamar BlueTM多功能细胞染色法测定阿霉素(ADR)对K562和K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50)及判断CsA的非细胞毒性剂量;采用RT-PCR法检测GCS基因和mdr1基因的mRNA表达。结果CsA浓度低于4.5μg/ml对K562/AO2细胞无细胞毒性。ADR对K562和K562/AO2细胞的IC50分别为(0.84±0.04)μg/ml和(89.24±1.27)μg/ml;当1μg/ml CsA和25μmol/L PPMP单用或联合作用于K562/AO2细胞时,ADR的IC50分别为(7.81±0.74)(、17.49±0.53)(、2.82±0.07)μg/ml;而低浓度CsA(0.01μg/ml)和PPMP(10μmol/l)联合作用时IC50为(16.08±1.25)μg/ml。CsA联合PPMP可明显降低GCS基因的mRNA表达,低浓度CsA和PPMP联用也有此作用。结论CsA联合PPMP可通过抑制K562/AO2细胞的GCS基因mRNA表达有效逆转其耐药,低浓度CsA联合PPMP在逆转其耐药的同时降低了细胞毒性。

多药耐药白血病细胞中GCS基因高表达及其意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因在细胞株K562/AO2和K562中的表达与白血病多药耐药(MDR)的关系。方法RT-PCR技术检测K562/AO2及K562细胞株的GCS和Bcl-2基因的表达;ELISA法检测两细胞株中Bcl-2及Caspase-3的表达;AlamarBlueTM细胞染色法分析K562/AO2细胞经苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)处理后多药耐药性的变化。结果K562/AO2细胞的GCS基因、Bcl-2基因和Bcl-2蛋白表达明显强于K562细胞(P<0.01),Caspase-3则相反(P<0.05)。K562/AO2细胞经25μmol/LPPMP处理后,GCS基因表达抑制,阿霉素(ADR)对其半数抑制浓度(IC50)明显降低。结论GCS基因可能在白血病MDR形成过程中起着重要作用,其机制可能为细胞凋亡相关基因的表达异常。PPMP通过抑制GCS活性有效逆转K562/AO2细胞的多药耐药性。