促进神经重组策略在脑卒中后步态康复中的应用

重建脑卒中患者行走能力、矫正病理步态是康复治疗的重要目标。促进神经重组是现代康复治疗的主要策略，本文侧重于从步态的中枢控制及如何促进神经重组这一角度对脑卒中后步态康复进行综述。

外源性重组人睫状神经营养因子抑制成人成肌细胞的体外分化

为探讨外源性重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)在成肌细胞分化中的作用,实验观察了0-10 ng/mlrhCNTF对成人成肌细胞体外分化的影响。结果表明,与对照组相比,2.5-10 ng/ml rhCNTF能显著抑制成肌细胞的体外分化(P<0.01),并呈量-效依赖关系,且这种抑制作用是可逆的。Western Blot分析提示,这种抑制作用伴有成肌细胞分化期特异标志myogenin和p21表达量的显著降低(P<0.01),以及成肌细胞增殖期特异标志myf5和desmin表达量的显著增加(P<0.01)。因此可以认为,外源性rhCNTF能可逆地抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖。

重组人睫状神经营养因子的复性研究

利用凝胶层析对人睫状神经营养因子原核基因工程产品进行复性研究， 发现此方法的复性率高于稀释透析法． 而且在复性的同时也进行了一步纯化工作． 该方法简单、迅速、高效、重复性好， 可用于规模生产．

重组人睫状神经营养因子对糖尿病大鼠胃肠功能的影响

目的评价重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对糖尿病大鼠胃肠道功能的作用。方法采用链脲佐菌素(strepto- zocin,STZ)诱发的糖尿病大鼠胃肠神经功能紊乱模型,肌注rhCNTF 0.1,0.3,0.9mg·kg^(-1),测定了rhCNTF对血糖、胃肠慢波电位、小肠壁内神经蛋白含量,观察了rhCNTF对胃肠推进功能的影响以及胃肠对乙酰胆碱(Ach)、阿托品敏感性的影响。结果肌内注射rhCNTF对血糖无明显影响,也未见rhCNTF改善十二指肠对Ach、阿托品的敏感性。肌注RhC- NTF可改善糖尿病大鼠胃肠慢波电位、提高了胃肠推进功能、增加了胃肠壁内神经蛋白含量。结论糖尿病导致的胃肠神经功能紊乱可以通过肌注rhCNTF而改善,其重要机制是rhCNTF对抗糖尿病引起的胃肠神经病变。

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入。

人重组睫状神经营养因子对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的影响

目的 探讨人重组睫状神经营养因子 (recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor,rhCNTF)对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用。方法 采用无创血管夹在成年鼠造成视神经不全损伤 ,治疗组玻璃体腔内注射rhCNTF ,对照组注射等量双蒸水。在损伤前、损伤后即刻及伤后 1、2、4、8和 12周检测伤眼闪光视觉诱发电位。结果 视神经损伤后即刻 ,闪光视觉诱发电位波形几近熄灭。伤后 1周 ,潜伏期 (LP1) 2组基本恢复至损伤前水平 ,与损伤前比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,组间比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。振幅 (AP1 N2 )恢复缓慢 ,伤后 1～ 2周治疗组与对照组比较无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;4周以后 2组间差异非常显著 (P <0 .0 1)。 8周时对照组恢复至损伤前的30 .84 % ,而治疗组恢复至 5 0 .35 % .

重组人睫状神经营养因子肽图分析

建立重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)的肽图分析方法,用于rh-CNTF的质量控制。胰蛋白酶对rhCNTF进行酶切后,利用RP-HPLC方法对酶切液进行分析,以获得胰蛋白酶切最佳条件及色谱条件,并对连续3批样品进行分析。rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为37℃酶切24h,以A(0.1%TFA-H2O)、B(0.1%TFA-CH3CN)为流动相,采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析,结果连续3批rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出峰数目与理论推测值相符。3批产品肽图的一致性为rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了rhCNTF产品质量控制的一项指标。

周围神经再生时重组CNTF对受损神经元STAT3表达和酪氨酸磷酸化的作用

目的 研究周围神经再生时 ,重组睫状神经营养因子 (CNTF)对受损神经元JAK STAT途径和酪氨酸磷酸化的作用。 方法 用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,术时在受损神经局部给予重组CNTF ,用免疫组织化学ABC法结合计算机图像分析研究STAT3、磷酸化酪氨酸 (PTyr)免疫反应阳性物质在L3～ 5段脊髓前角外侧核和L5脊神经节神经元中的分布和相对含量。 结果 与生理盐水组相比 ,CNTF组脊髓前角外侧核神经元胞核STAT3和胞膜PTyr阳性物质的含量更高 ,脊神经节神经元胞浆和胞核PTyr阳性物质的含量更高。 结论 重组CNTF能激活和强化受损运动神经元的JAK STAT途径 。

重组蝎毒抗神经兴奋肽的ELISA分析方法建立及稳定性的初步研究

目的建立重组蝎毒抗神经兴奋肽（ANEP）的ELISA分析方法并对ANEP的稳定性进行初步研究。方法以分别建立的间接ELISA和间接竞争ELISA分析方法进行ANEP含量测定，并通过方法学的优化，最终以建立的间接法ELISA方法测定了温度、pH值、反复冻融、超声对ANEP稳定性的影响。结果间接ELISA相对于间接竞争ELISA有着更好的线性关系和灵敏度，线性范围0.025-1.60μg／mL。检测限为10ng／mL。稳定性实验表明ANEP在37，60℃的条件下放置24h含量基本不变，pH5-11的缓冲液中保持稳定，反复冻融、超声4min后含量降低。结论所建立的间接ELISA方法能很好的用于ANEP的测定。ANEP的热稳定性较好，强酸性下不稳定，对反复冻融与超声等稳定性较差。

凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子中细菌内毒素含量

目的采用凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子(CNTF)中细菌内毒素含量,控制制品质量,消除临床热原反应的发生。方法供试品参照《中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法和动态浊度法要求进行检查。结果注射用重组人睫状神经营养因子溶液在100μg/mL质量浓度下,确定内毒素限值为10 EU/mL。凝胶法和动态浊度法检查后,注射用重组人睫状神经营养因子内毒素含量均符合规定。结论凝胶法和动态浊度法可用于注射用重组人睫状神经营养因子的细菌内毒素检查。

重组人睫状神经营养因子干预家兔视神经损伤动物模型视神经蠕变特性的分析

以蠕变特性指标研判重组人睫状神经营养因子干预动物视神经损伤的效果。以钳夹法复制动物视神经损伤模型,以重组人睫状神经营养因子连续干预30 d后,对各组动物进行视觉电生理检测,之后取各组动物视神经进行组织形态观察和蠕变实验。视神经损伤模型以重组人睫状神经营养因子干预治疗组Pl峰值大于视神经损伤模型组,差异显著(P<0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗组视神经纤维结构尚存,较少部分视神经纤维排列不规则,视神经无明显变细,视神经损伤模型组兔视神经纤维束结构消失,神经纤维和胶质细胞变性、坏死。视神经损伤以重组人睫状神经营养因子干预治疗组7 200 s应变上升量大于视神经损伤模型组组、差异显著(P<0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗动物视神经损伤模型后视神经的织形态、蠕变特性等得到较大的恢复。

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx-BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21穴DE3雪,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83%的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。

一种新的重组蝎抗神经兴奋肽对原代培养的大鼠海马神经元钠电流的影响

目的研究重组蝎抗神经兴奋肽(ANEPⅢ)对培养大鼠海马神经元钠电流以及通道动力学的影响。方法采用全细胞膜片钳记录模式考察海马神经元钠通道电流的变化。结果ANEPⅢ可显著降低海马神经元钠电流,并呈剂量依赖性,半数抑制浓度为214.76nM。离子通道动力学研究表明ANEPⅢ对海马神经元钠电流的稳态失活无明显影响,可使钠电流的恢复减慢。结论重组蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ可抑制培养大鼠海马神经元钠电流,使其复活过程减慢,这可能与其发挥功能活性密切相关。

重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立

采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。

重组人睫状神经营养因子对在体和离体大鼠成肌细胞不同作用比较

目的:观察重组人睫状神经营养因子对在体和离体大鼠成肌细胞的生物学作用。方法:通过混合酶消化和差速贴壁分离纯化大鼠成肌细胞,用含有不同浓度的重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)的分化液培养,观察成肌细胞增殖分化的改变情况。另外,采用胫前肌肌内注射 rhCNTF,随后利用免疫组化的方法观察在体大鼠成肌细胞的变化情况。结果:2.5～10ng/ml rhCNTF 能显著抑制亚融合成肌细胞的体外分化(P<0.01),这种抑制作用呈量效依赖性,且其作用是可逆的。rhCNTF 对在体成肌细胞前体肌卫星细胞的影响不明显,但能够使肌纤维较对照组增粗。结论:在体和离体大鼠成肌细胞对重组人睫状神经营养因子的反应性存在差异。

重组人睫状神经因子(rhCNTF)对谷氨酸钠肥胖大鼠减肥作用机制的实验研究

目的研究短、长期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠的减肥作用机制,为新药开发提供药理动物实验依据。方法建立谷氨酸钠(MSG)大鼠模型。3月龄时将肥胖动物随机分10组,长、短周期各5组分别给药。长周期连续给药33 d,短周期连续给药10 d。末次给药24 h后空腹断头,取生殖器周围同一部位小块脂肪组织经10%福尔马林固定后做光镜检查(400倍),取三个视野计数全视野脂肪细胞数并计算平均值;取空肠固定于电镜液,电镜扫描观察空肠绒毛密度及相对吸收表面积大小。结果 1)造模:正常大鼠体质量为(189.40±38.72)g,谷氨酸钠肥胖大鼠平均体质量为(246.72±36.67)g,(P<0.001);LI(Lee's指数)分别为289.27±9.05和304.42±9.64(P<0.001)。说明造模成功。2)药物实验结果中,短周期给药组:高、中剂量组脂肪细胞体积变小,高剂量组空肠绒毛密度下降,相对吸收面积减小(P<0.01或P<0.05);长周期给药:高、中剂量组脂肪细胞体积变小,空肠绒毛密度下降,相对吸收面积减小(P<0.01或P<0.05)。结论每天皮下注射rhCNTF 30～300μg/kg使谷氨酸钠肥胖大鼠的脂肪细胞变小,减肥作用与减小空肠绒毛膜吸收面积有关,作用呈剂量依赖性。

重组人神经生长因子对糖尿病大鼠难愈创面愈合的影响

目的研究重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rh NGF)对糖尿病大鼠合并难愈创面的治疗效果。方法腹腔注射链脲佐菌素(60 mg·kg^(-1))诱导大鼠糖尿病模型,并在大鼠背部造成一圆形烫伤创面,建立糖尿病合并难愈创面的动物模型。用药组rh NGF(3、6、12μg·kg^(-1))肌肉注射给药,每天1次,连续21 d。测定大鼠伤口面积,HE染色和透射电镜检查创面皮肤组织病理形态学变化。结果 rh NGF明显减小糖尿病大鼠烫伤创伤面积(P <0. 05); HE染色结果表明,rh NGF明显促进糖尿病大鼠烫伤创面纤维细胞和毛细血管再生;透射电镜结果表明,rh NGF对糖尿病大鼠烫伤创面皮肤的上皮细胞结构排列、细胞连接以及上皮下胶原等超微结构有明显改善作用。结论rh NGF对糖尿病大鼠烫伤性难愈创面具有促进愈合的作用。

重组人睫状神经因子的表达、纯化以及聚乙二醇修饰

目的研究重组人睫状神经因子(rh-CNTF)的表达、纯化及聚乙二醇化修饰、纯化方法。方法重组人睫状神经因子(rh-CNTF)工程菌经37℃培养至对数生长期,加入IPTG诱导4h,经QSepharose F.F凝胶柱纯化和复性后得到纯化的rh-CNTF。以体外培养鸡胚背根神经节(DRG)方法测定重组蛋白rh-CNTF的神经营养活性。用单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-ButyrALD-20k)对rh-CNTF进行修饰,所得修饰产物经DEAESepharose F.F和Superdex 75凝胶分离纯化后获得mPEG-rh-CNTF偶联物。结果目的蛋白占总蛋白30%左右,为包涵体,经QSepharose F.F凝胶柱纯化和复性,获得纯度达90%的rh-CNTF。表达的rh-CNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。修饰后的单聚PEG-rhCNTF经DEAESepharose F.F和Superdex 75凝胶纯化后纯度达到95%。结论确立了rh-CNTF蛋白表达纯化及PEG修饰的方法。

重组人睫状神经营养因子突变体对小鼠代谢综合征的作用研究

目的：在2型糖尿病的早期，胰岛素抵抗是一系列潜在的心血管疾病高危因素的协同因素，这一系列代谢性疾病通常称为代谢综合征。该综合征最初以胰岛素抵抗作为主要的代谢性缺陷并伴发一些疾病，如高血压、高脂血症和中心性肥胖症。随着时间延长，该综合征的组成成份继续增加，最终促进了动脉粥样硬化性心血管病和2型糖尿病的发生。

重组人睫状神经因子聚乙二醇化条件的优化

目的对单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-ButyrALD,相对分子质量20×103)修饰重组人睫状神经因子(rh-CNTF)的条件进行优化。方法优化了pH值、温度、时间、rh-CNTF与PEG的修饰比例、rh-CNTF浓度等修饰条件,并对修饰产物行分离纯化。鸡胚背根节培养法检测和比较rh-CNTF和PEG-rhCNTF的体外生物学活性。结果rh-CNTF与PEG的修饰比例、rh-CNTF的浓度和pH值是主要影响因素,最佳pH为6.5,最佳rh-CNTF浓度为1～2 mg/ml,rh-CNTF与PEG的最佳质量比为1∶1,时间和温度影响甚微。rh-CNTF的体外神经营养活性约为PEG-rhCNTF的2倍。结论本法优化了修饰重组人睫状神经因子的条件。