大鼠各组织中和PC12细胞中神经限制性沉默因子(NRSF)全长转录本的检测及部分序列的克隆

检测了大鼠的心、肝、肾、脑组织和不同培养条件下的PC12细胞中的NRSF全长转录本,了解到NRSF全长转录本存在于以上所有组织和细胞中,该基因受到转录后加工水平的调控,并且成功将NRSF基因片段IV整合到大肠杆菌基因组中,为今后对该基因的进一步研究奠定了基础.

神经元限制性沉默因子显著调节基因在神经母细胞瘤发病中作用的统计分析研究

目的 :神经元限制性沉默因子(R EST)为负调控基因,通过研究REST在神经母细胞瘤中的作用,探讨神经母细胞瘤的发病机制。方法:神经母细胞瘤的患者样本数据从Gene Expression Omnibus数据中心获得,应用生物信息学技术分析REST显著调节基因的表达量和神经母细胞瘤的分级、染色体11q23位置的杂合性丢失和MYCN基因异常活化的关系。结果:高级的神经母细胞瘤患者样本中REST显著调节基因的表达量(REST score)明显增高。11q23位置的杂合性丢失和REST score趋于正相关,而REST score和MYCN基因异常活化未见明显的相关性。结论:在神经母细胞瘤中REST基因为致癌基因,REST基因的显著调节基因的表达量和神经母细胞瘤的临床表现有关。

神经元限制性沉默因子在干细胞发育及分化中的作用

神经元限制性沉默因子NRSF/REST(neuron-restrictive silencer factor,NRSF;又称RE-1 silencing transcription factor,REST)是一种具有锌指结构的蛋白质,通过与特异的作用元件NRSE(neuron-restrictive silencer element,NRSE;又称Repressorelement,RE1)相结合,调节靶基因的转录.NRSF/REST通过与多种辅助因子的相互作用不同程度地影响靶基因的表达,其功能受到干扰则导致多种病理状态.近年来研究表明,NRSF/REST蛋白参与调控胚胎干细胞自我更新和全能性的维持,及干细胞的定向分化等多个生理过程.综述了最近NRSF/REST的研究进展,探讨其在胚胎干细胞自我更新、胚胎早期发育,以及干细胞向神经元、胰岛细胞分化中的作用.

神经元限制性沉默因子与胰岛素在成年小鼠胰腺中的表达

目的:观察神经元限制性沉默因子(NRSF)在正常成年小鼠胰腺组织中的表达情况。方法:以6～8周BALB/c小鼠胰腺为实验材料,制备冰冻切片,与地高辛标记的NRSF cDNA探针进行原位杂交,观察mRNA表达,并结合免疫组织化学方法检测NRSF和胰岛素的表达。结果:原位杂交显示,NRSF mRNA仅表达于胰腺组织外分泌部腺泡腺细胞中,胞浆呈蓝紫色,与免疫荧光组织化学检测NRSF蛋白表达的部位一致,而胰岛细胞中无NRSF mRNA及蛋白的表达。免疫酶组织化学染色显示,胰岛大部分细胞中表达胰岛素,胞浆染成黄棕色,而腺泡腺细胞则不表达胰岛素。结论:NRSF与胰岛素不存在共定位关系,即成年小鼠胰岛细胞不表达NRSF,而表达胰岛素。提示NRSF蛋白表达的消失可能是建立完全分化成熟、具有完好分泌反应的胰岛细胞所必需的。

神经元限制性沉默因子在NTera2/CloneD1细胞向神经元分化模型中表达的检测

目的:建立NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,检测神经元限制性沉默因子(NRSF)经分化培养基诱导后表达的变化。方法:收集正常培养的NTera2/CloneD1细胞及经全反式维甲酸(RA)、阿糖胞苷(AraC)、尿苷分阶段诱导共28 d的细胞,显微镜下观察诱导前后细胞的形态学变化;免疫荧光法检测NTera2/CloneD1细胞诱导前后干性标志Nestin、Sox2和成熟神经元特异性标志NF-200、β-tubulinⅢ的表达情况;应用RT-PCR和免疫荧光法对NRSF进行mRNA和蛋白水平的检测。结果:显微镜下观察到正常培养的NTera2/CloneD1细胞呈克隆样生长,经分化培养基诱导后的NTera2/CloneD1细胞表现出典型的神经元样细胞形态。免疫荧光检测表明,未诱导的NTera2/CloneD1细胞表达神经干细胞的标志Sox2、Nestin,不表达成熟神经元特异性蛋白NF-200、β-tubulinⅢ;而经RA等诱导分化的细胞则不表达Sox2、Nestin,表达NF-200、β-tubulinⅢ。RT-PCR和免疫荧光检测显示,NRSF在诱导分化后的NTera2/CloneD1细胞中的表达量显著降低。结论:建立了NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,NRSF在诱导后的NTera2/CloneD1细胞中表达量显著下调,提示NTera2/CloneD1细胞在诱导过程中可能通过下调NRSF,使受到NRSF负性调控的神经元特异性蛋白启动表达并上调,进而实现NTera2/CloneD1细胞向神经元的定向分化。

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.

瑞芬太尼痛觉过敏小鼠中脑导水管周围灰质Mu阿片受体和神经元限制性沉默因子表达水平的变化

目的:观察瑞芬太尼痛觉过敏小鼠中脑导水管周围灰质(periaquductal gray,PAG)中Mu阿片受体(Mu-opioid receptor,Mor)和神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor,NRSF)表达水平的变化。方法:32只小鼠采用随机数字表法随机分入4组(n=8):对照组(C组)、切口痛组(I组)、瑞芬太尼组(R组)和切口痛+瑞芬太尼组(IR组)。采用Von Frey细丝和BME-410A型热痛刺激仪测量小鼠术前24 h和术后2,6,24,48 h的机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical thresholds,PWMT)和热缩足反射潜伏期((paw withdrawal thermal latency,PWTL)。Western印迹检测术后48 h小鼠PAG中Mor和NRSF的表达水平。结果:与C组和术前基础值比较,I组、R组和IR组术后2~48 h PWMT和PWTL均显著降低(P<0.01);术后2,6 h时R组较I组PWMT和PWTL略高(P<0.01),术后24,48 h时两组间差异无统计学意义(P>0.05);与I组比较,IR组术后PWMT和PWTL显著降低,并持续到术后48 h(P<0.01)。与C组和I组比较,R组和IR组Mor表达均显著降低(P<0.01),NRSF表达显著升高(P<0.01),C组和I组之间Mor和NRSF表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:术中短时程输注瑞芬太尼可诱导小鼠术后痛觉过敏,同时瑞芬太尼还诱导PAG中Mor水平降低及NRSF水平增加,该变化可能参与瑞芬太尼诱导的痛觉过敏的形成。

不止是沉默——神经元限制性沉默因子及其作用元件的研究进展

神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor,NRSF;又称repressor element silencing transcription factor,REST)是一种锌指(zincfinger)蛋白,它能与某些基因中相应的神经元限制性沉默元件(neuron-restrictive silencer element,NRSE;又称repressor element-1,RE-1)相结合,使序列中的组蛋白发生去乙酰化,从而对某些神经性基因的表达发挥阻遏作用。随着研究的深入,人们发现NRSF-NRSE在神经发育过程中有着复杂的调控功能,这主要是由于NRSF/NRST蛋白及REST辅助蛋白(CoREST)介导的甲基化作用,NRSF蛋白转录后形成的一系列剪切体也可能参与其中。另外,NRSF及其不同的剪切体还与一些神经系统疾病和肿瘤的发生密切相关。深入研究NRSF的调控机制对于进一步了解一些神经系统疾病的发生有着重要意义。

神经元限制性沉默因子与大鼠骨髓间充质干细胞向神经元诱导分化的关系

目的分析神经元限制性沉默因子(NRSF)以及NRSF调控的基因在β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化过程中表达的变化,探讨NRSF在大鼠MSCs向神经元分化的作用及MSCs向神经元分化的机制。方法采用β-巯基乙醇、无血清的DMEM培养液和二甲基亚砜诱导大鼠MSCs分化成神经元,再通过实时定量PCR分析NRSF以及NRSF调控的基因在诱导前后表达的变化。结果应用β-巯基乙醇、无血清DMEM培养液和二甲基亚砜的诱导方案可以将MSCs诱导分化成神经元样细胞,诱导后的细胞神经元标记物神经元特异性烯醇化酶呈阳性,实时定量PCR检测NRSF基因表达显著下调,NRSF的靶基因神经营养酪氨酸激酶三型受体、突触相关蛋白25、L1细胞黏附分子、神经元钙结合蛋白受体表达有不同程度的上调。结论MSCs的神经元分化与NRSF下调及其调控的神经元分化相关基因表达上调有关。NRSF很可能是MSCs向神经元方向分化的关键基因,抑制NRSF表达可能是促进MSCs向神经元分化的关键步骤。

杏仁核快速电点燃癫痫大鼠神经元限制性沉默因子表达变化

目的研究杏仁核快速电点燃癫痫中神经元限制性沉默因子(repressor element silencing transcription factor,REST)表达变化。方法成年Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(S组)、癫痫模型2 h组(EP-2 h组)、癫痫模型14 d组(EP-14 d组)和癫痫模型35 d组(EP-35 d组);癫痫采用杏仁核快速电点燃刺激法建立大鼠癫痫模型,癫痫模型成功后2 h、14 d及35 d时,灌注、固定、冰冻切片,行神经元限制性沉默因子(REST)及神经元核蛋白(neuron specific nuclear protein,Neu N)免疫组化学染色。结果与S组比较,EP各组大鼠海马区REST表达均上调,且EP-2 h组上调最明显(P<0.05);而EP各组大鼠海马区Neu N的表达降低,有明显的神经元丢失,35 d最明显。结论杏仁核快速电点燃癫痫的形成可能与REST表达上调有关。

LW-AFC调节神经元限制性沉默因子改善学习记忆作用机制的初步研究

目的研究六味地黄苷糖(LW-AFC)对慢性应激小鼠学习记忆的调节作用,并探讨LW-AFC影响应激学习记忆的作用机制是否与调控神经元限制性沉默因子(REST)有关。方法应用雄性BALB/c小鼠,采用8种不同应激条件组合,进行慢性多重应激4周建立应激模型。自应激开始即灌胃给予LW-AFC(1.6 g·kg^-1)。应用新物体识别实验和在体记录长时程增强(LTP)检测学习记忆能力的变化;采用放射免疫试验检测HPA轴的变化,包括血清皮质酮、垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)及下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)含量;应用Western印迹法检测海马组织N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2A和NR2B亚基以及REST蛋白表达。结果慢性多重应激4周后,应激小鼠新物体辨识指数明显降低(P<0.05),海马DG区LTP显著降低(P<0.01)。而给予LW-AFC可明显提高新物体辨识指数(P<0.05),升高海马DG区LTP的诱发(P<0.01)。LW-AFC可显著降低慢性多重应激小鼠的皮质酮(P<0.05)及CRH(P<0.05)含量;LW-AFC可明显升高海马组织中REST含量(P<0.05);并可升高NMDAR2A含量(P<0.05),从而增加NMDAR2A/2B比例。结论慢性应激4周可引起小鼠学习记忆能力减退。LW-AFC对慢性多重应激所致学习记忆损伤具有改善作用,其作用机制可能与改善HPA轴紊乱、升高REST含量、调节NMDAR2A/2B的平衡有关,提示LW-AFC可能通过影响REST信号通路发挥了抗应激作用,LW-AFC有望发展成为抗应激药物。

REST显著调节基因对腹部神经母细胞瘤敏感性药物选择的作用研究

目的:探讨根据REST显著调节基因的表达量选择腹部神经母细胞瘤敏感性药物的方法。方法:神经母细胞瘤细胞株的基因表达信息和药物敏感性数据从Genomics of Drug Sensitivity in Cancer数据库获得,应用生物信息学技术分析REST显著调节基因的表达量和IC50的关系。结果:29种神经母细胞瘤细胞株可根据REST显著调节基因的表达量(RESTscore)进行分类,Bryostatin.1和NVP.BEZ235对RESTscore高的神经母细胞瘤细胞株作用效果明显,而ABT.263和Sunitinib对REST score低的神经母细胞瘤细胞株作用明显。结论:可以根据REST显著调节基因表达量的不同选择对神经母细胞瘤敏感的化疗药物,为神经母细胞瘤的个体化治疗提供理论基础。

榄香烯对神经母细胞瘤增殖的抑制作用

目的观察榄香烯对神经母细胞瘤增殖的抑制作用,并探讨其作用机制。方法培养SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株。采用MTT法测定榄香烯对SK-N-SH细胞的抑制率,应用实时qPCR和Western blotting法测定榄香烯对SK-N-SH细胞中神经元限制性沉默因子(REST)的调控作用,并进一步用实时qPCR检测SK-N-SH细胞中细胞周期相关基因CCND1和CCNE1的表达。结果榄香烯对SK-N-SH细胞的增殖有明显的抑制作用(P=0.001 16),并呈时间和浓度依赖性;榄香烯下调REST mRNA(P=0.000 38)和蛋白表达(P=0.003 39),并且抑制细胞周期相关基因CCND1 mRNA表达(P=0.001 91)和CCNE1 mRNA表达(P=0.000 15)。结论榄香烯对神经母细胞瘤的增殖有抑制作用,并且抑制其REST和细胞周期相关基因CCND1和CCNE1的表达。

REST和CoREST在神经细胞分化发育过程中的调节作用

神经元限制性沉默因子（neuron-restrictive silencer factor，NRSF），是一种重要的锌指蛋白转录负调控因子，它与某些基因中相应的神经元限制性沉默元件（neuron restrictive silencer element，NRSE），又称RE-1（repressor element1，RE-1）相结合，从而对许多与神经元发育及功能相关的基因的表达发挥阻遏作用。REST辅助抑制因子（REST corepressor，CoREST）是一种神经元表型调控因子，CoREST与REST的C端结构域（含有一个C2H2型锌指结构）结合，形成阻遏复合物，发挥转录抑制作用。本文就REST和CoREST在神经发育过程中的调控作用进行综述。

超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道1在杏仁核快速电点燃癫痫大鼠神经元中表达下调

为研究杏仁核快速电点燃癫痫中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道1(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN1)表达变化,成年Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(S)、癫痫模型2h组(EP-2 h)、癫痫模型14d组(EP-14 d)和癫痫模型35 d组(EP-35 d);采用快速电点燃刺激杏仁核方法建立癫痫大鼠模型,观察各组大鼠行为学的变化,研究了海马神经元中HCN1的免疫荧光及3,3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)免疫组化表达情况。结果表明:与S组比较,HCN1的免疫荧光显示EP各组海马部位HCN1阳性表达细胞数均减少,且EP-14 d及EP-35 d组减少最明显(P <0. 05); DAB免疫组化显示EP各组HCN1阳性表达均低于S组,且EP-14 d及EP-35 d组降低最明显(P <0. 05)。可见在杏仁核快速电点燃癫痫大鼠模型中,HCN1下调可能参与癫痫的发生和发展。

CNTF联合RA诱导成肌细胞类神经分化及与REST的相关性

目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)联合视黄酸(RA)诱导成肌细胞类神经分化的方法以及该诱导过程与神经元限制性沉默因子(REST)相关性。方法以CNTF诱导C2C12去分化,再以RA诱导C2C12类神经分化。通过细胞形态学、细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot等技术对去分化及类神经分化的细胞进行鉴定及相关分析,比较细胞类神经分化前后REST表达变化。结果诱导后细胞聚集生长,呈典型的神经球样。细胞免疫荧光染色显示神经球能够被神经特异性标志物NSE、Sox1、GFAP标记,神经球离散为单个细胞接种后生长状态良好,神经干细胞标志物(nestin)呈阳性表达。Western blot结果显示CNTF去分化诱导后成肌细胞分化相关蛋白Myogenin、P21表达降低,类神经分化后NSE、Sox1、GFAP表达增多,且成肌细胞特异性标志物Desmin及REST表达下降。流式细胞仪分析表面标志物NSE显示诱导组与对照组比较细胞有差异,且诱导组特异性阳性细胞率达84%左右。结论 CNTF联合RA可诱导成肌细胞类神经分化,且该诱导过程可能与REST表达降低相关。

过表达促红细胞生成素脐带间充质干细胞抑制缺血缺氧SH-SY5Y细胞凋亡及机制

背景:前期研究成功构建过表达促红细胞生成素的脐带间充质干细胞(erythropoietin-overexpressed umbilical cord mesenchymal stem cells,EPO-MSCs),发现其可以显著减少缺血缺氧人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞的凋亡。目的:探究EPO-MSCs对缺血缺氧SH-SY5Y细胞可能的神经保护机制及其相关表观遗传学机制。方法:用氧-葡萄糖剥夺法缺血缺氧诱导SH-SY5Y细胞损伤,分别与慢病毒转染空载质粒的脐带间充质干细胞(NC-MSCs)、EPO-MSCs共培养后进行转录组测序,根据组间差异基因进行相关分析。同时应用多因子法检测缺血缺氧性脑病患者和对照组脑脊液上清及共培养细胞上清炎性因子表达水平。蛋白组学检测NC-MSCs、EPO-MSCs差异表达蛋白。应用染色体靶向切割和标签化(CUT&Tag)测序技术检测基因组H3K4me2修饰情况,并与转录组测序联合分析。慢病毒载体感染构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,应用qRT-PCR、Western blot检测REST的表达水平,然后再缺血缺氧处理并与EPO-MSCs共培养,流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Western blot检测H3K36me3组蛋白的表达差异,然后进行转录组测序分析差异表达基因。结果与结论:①与对照组比较,缺血缺氧性脑病患者脑脊液上清中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、白细胞介素18、白细胞介素1β、干扰素α2、白细胞介素23水平显著增加(P<0.01);②缺血缺氧SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6表达水平明显降低;③蛋白质网络相互作用分析发现单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6相关调控蛋白CXCL1、BGN等显著下调;④转录组测序分析发现EPO-MSCs组SH-SY5Y细胞中促炎基因较NC-MSCs组显著下调,组蛋白修饰的功能富集以及转录因子REST、TET3的表达显著上调;⑤转录组测序与CUT&Tag联合分析发现表观遗传水平变化以及转录因子REST和TET3启动子区域显著激活;⑥成功构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,REST mRNA转录水平和蛋白表达均降低;⑦缺血缺氧处理敲低REST的SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后细胞凋亡显著增加、H3K36me3表达显著降低,转录组测序显示炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2在mRNA转录水平表达降低(P<0.01);⑧结果表明:EPO-MSCs通过分泌组的改变影响H3K4me2的峰度从而激活REST、TET3的表达,上调H3K36me3的修饰水平,进而调控炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2的表达,促进神经元的存活。

茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后NRSF和BDNF蛋白表达的影响

[目的]研究茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后神经元限制性沉默因子(NRSF)和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。[方法]建立戊四唑点燃癫痫模型,分为中药高、中、低剂量组、西药组、模型组和空白组,用蛋白免疫印迹杂交法检测各组NRSF和BDNF蛋白的变化。[结果]幼年大鼠致痫后模型组海马NRSF和BDNF蛋白表达升高,中药高剂量组可显著降低大鼠海马齿状回NRSF和BDNF蛋白表达(P<0.01),作用优于西药组和其他中药组。[结论]中药复方茸菖胶囊抗癫痫及改善癫痫后认知障碍机制可能与调控组蛋白乙酰化修饰及其所介导的神经元基因表达有关。

NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.