神经鞘磷脂合成酶基因沉默对细胞凋亡的影响

以HEK293细胞为模型,利用RNA干扰技术,将神经鞘磷脂合成酶(SMS)的同工酶(SMS1和SMS2)的siRNA分别联合、转染HEK293细胞.通过薄层层析法评价SMS酶活性,同时测神经酰胺(Cer)、卵磷脂(PC)及神经鞘磷脂(SM)的水平,并以流式细胞仪和AnnexinV-FITC、PI双染法检测细胞凋亡.结果显示,与对照组相比,SMS基因沉默后SMS表达水平降低(分别降低17%,20%,49%);SM水平显著性降低(P<0.05);Cer水平显著性升高(P<0.05);TNF-α诱导的凋亡显著性升高[分别为58%(P<0.01),24%(P<0.05),77%(P<0.01)].这些结果提示,SMS基因沉默能降低SM水平并升高Cer水平,明显增加TNF-α诱导的HEK293细胞凋亡.由于SM是动脉粥样硬化形成的独立危险因子,因此本研究有可能为动脉粥样硬化的治疗找到新的靶点和有效途径.

长期酒精暴露诱导胰岛素抵抗及视网膜微血管损伤:神经鞘磷脂的可能作用

目的探讨长期酒精暴露诱导胰岛素抵抗对小鼠血视网膜屏障的损伤以及神经鞘磷脂(SM)可能的作用。方法选取神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)基因敲除(SMS2-/-)和野生型(WT)小鼠76只,酒精暴露建立动物模型。用血糖仪测定血糖浓度,酶联免疫法(ELISA)测定血胰岛素浓度,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),利用免疫荧光染色、HE和电子显微镜观察血视网膜屏障的损伤。结果长期酒精暴露引起小鼠胰岛素抵抗(P<0.05),并出现血视网膜屏障的损伤,如无细胞毛细血管数增多(P<0.05),星形胶质细胞数量减少(P<0.05),内皮细胞和周细胞线粒体肿胀,嵴消失,基底膜欠清晰,呈剂量依赖性。和WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠胰岛素抵抗指数较小和血视网膜屏障损伤程度较轻(P<0.05),提示SMS2-/-小鼠有延缓胰岛素抵抗形成和减少血视网膜屏障损伤的作用。结论长期酒精暴露可以诱导胰岛素抵抗,并造成血视网膜屏障损伤,具有剂量依赖性;SMS2基因的缺失有延缓胰岛素抵抗的产生和减少血视网膜屏障损伤的作用。

酸性神经鞘磷脂酶的生物学特性及其功能

神经鞘磷脂酶(SMase)可水解鞘磷脂产生神经酰胺,在人体内发挥重要作用。酸性神经鞘磷脂酶(ASMase)作为SMase最重要的一个亚型,在辐射诱导细胞凋亡、调节肿瘤细胞生长、参与Fas信号系统传递等方面均可发挥重要作用。

HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12细胞内神经鞘磷脂合成酶活性比较

目的:分析比较HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12的细胞内神经鞘磷脂合成酶(SMS)的活性。方法:收集处于对数生长期的HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12细胞,每种细胞的细胞浓度相同;5种细胞均建立2个酶促反应体系,反应时间分别是2 h和3.5 h;薄层层析和灰度扫描分析比较SMS活性强弱。结果:HEK293细胞内的SMS活性较强。结论:建立了有效检测不同来源细胞SMS活性比较的方法,发现HEK293细胞具有较强的SMS活性,可以更好的用于神经鞘磷脂代谢的研究。

神经鞘磷脂酶在人乳腺癌组织中的表达

目的通过观察人乳腺癌组织中神经鞘磷脂合成酶SMS1和SMS2的表达，探讨SMS1和SMS2与乳腺癌发生、发展的关系。方法收集手术切除的人乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织，用免疫组织化学方法和免疫印迹法检测20例乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中SMS1和SMS2的表达水平，并用Image—proplus6．0图像分析系统对实验结果进行分析。结果免疫组化结果显示，乳腺癌组织中SMS1阳性表达强度（MOD：0．34±0．012）明显高于对应癌旁乳腺组织（MOD：0．150±0．021），乳腺癌组织中SMSl阳性表达的细胞数量（SD：19．63±2．41）明显多于对应癌旁乳腺组织（SD：6．32±4．13），P值均〈0．05；乳腺癌组织中SMS2阳性表达强度（MOD：0．401±0．013）明显高于对应癌旁乳腺组织（MOD：0．175±0．011），乳腺癌组织中SMS2阳性表达的细胞数量（SD：21．45±6．11）明显多于对应癌旁乳腺组织（SD：5．39±1．30），P值均〈0．05；免疫印迹法检测结果显示，乳腺癌组织中SMS1和SMS2蛋白表达水平均明显高于对应癌旁乳腺组织（P〈0．05）。结论SMSl和SMS2在乳腺癌组织中高表达，可能与乳腺癌的发生、发展有关。

孕期酒精暴露诱导神经鞘磷脂合成酶2基因敲除小鼠海马苔藓细胞凋亡

目的探讨神经酰胺对孕期酒精暴露所诱导的小鼠神经细胞凋亡的影响。方法建立神经鞘磷脂合成酶2基因敲除(SMS2-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠的孕期酒精暴露模型,将出生后的不同基因型仔鼠(共360只)分为对照组和酒精组。用酶学法检测生后0 d(P0)仔鼠血清神经鞘磷脂(SM)含量,利用免疫荧光染色法观察对照组与模型组各年龄点仔鼠齿状回苔藓细胞凋亡数量的变化,免疫印迹法检测P7、P14仔鼠海马组织Caspase-8、Caspase-3激活蛋白的相对表达量。结果酒精暴露后仔鼠血清SM水平降低,且具有剂量依赖性(F=41.08,P<0.05);SMS2-/-仔鼠血清SM水平低于同组WT仔鼠(F=53.34,P<0.01)。酒精诱导WT和SMS2-/-仔鼠苔藓细胞凋亡(F=15.61,P<0.05),有剂量依赖性和长时程效应,与同年龄、相同处理条件的WT仔鼠相比,SMS2-/-仔鼠苔藓细胞凋亡数量较多(F=11.72,P<0.05)。Western blotting检测结果与免疫荧光结果一致。结论 SMS2基因缺失使血清SM水平降低,可引起神经酰胺在体内蓄积;神经酰胺促进酒精暴露诱导神经细胞凋亡的过程;孕期酒精暴露主要通过死亡受体途径诱导神经细胞凋亡的发生。

脂质筏神经鞘磷脂在T细胞活化中的作用

机体通过正确地调节活化免疫细胞的信号传递,抵抗入侵的病原微生物。其中获得性免疫起主要作用,主体为T淋巴细胞或B淋巴细胞。细胞膜上的T细胞受体集中在免疫突触的中央,与抗原提呈细胞结合形成免疫突触[1]。1972年Nicolson提出细胞膜液态镶嵌模型,当时这一重大发现在学界引起了轰动。

甲状腺功能低下大鼠血浆激素和脑红细胞膜神经鞘磷脂变化

目的为了了解大鼠实验甲低条件下，血浆激素、脑、红细胞膜神经鞘磷脂的变化。方法应用薄层色谱扫描法，观察了甲基硫脲嘧啶（ＭＴＵ）复制甲状腺功能低下大鼠甲状腺重量、血浆Ｔ３、Ｔ４及脑和红细胞膜神经鞘磷脂（ＳＭ）变化。结果持续用ＭＴＵ组甲状腺重量及脑和红细胞膜ＳＭ明显增加，血浆Ｔ３、Ｔ４水平下降，随着停ＭＴＵ时间不同，其变化不同。结论甲状腺激素不足，可能通过脑。

神经鞘磷脂合成酶2基因敲除对小鼠血清高密度脂蛋白3功能的影响

背景和目的已有报道显示，神经鞘磷脂合成酶2基因缺失（sphingomyelinsynthase2knockout，SMS2。一）有抗动脉粥样硬化及抗炎作用。本文以SMS2I／一小鼠为研究对象，旨在探讨神经鞘磷脂（sphingomyelin，sM）代谢与血清高密度脂蛋白（high—den—sitylipoprotein，HDL）抗氧化、抗炎症、保护内皮能力之间的关系。方法雄性28周龄SMS2-/-小鼠16只为实验组，同性别同周龄C57BL／6J（wild—type，wT）小鼠16只为对照组。禁食12h后眼球取血，酶学方法检测血脂，超速离心法提取血清HDL3，测定HDl3抗铜离子诱导脂蛋白氧化的能力（以生成TBARS含量表示）、

血脂异常患者血清神经鞘磷脂的测定及其意义

目的:评价血脂异常患者血清神经鞘磷脂(SM)水平。方法:将血脂异常的患者分为总胆固醇(TC)升高组、三酯酰甘油(TG)升高组、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高组和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低组,与对照组SM水平比较。酶法测定SM、TC、TG、LDL-C、HDL-C。用单因素方差分析,Dunnett检验处理数据。结果:血脂异常患者SM水平与对照组比较有显著性差异(P<0.05);TC、LDL-C升高组SM水平与对照组比较有显著性差异(P<0.05),TG升高组、HDL-C降低组SM水平与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。结论:血清SM水平和已知的致动脉粥样硬化危险因子密切相关,提示SM可能是导致动脉粥样硬化发生的重要因素。

神经鞘磷脂合成酶2基因敲除小鼠的饲养繁殖和鉴定

目的:繁殖和鉴定神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)基因敲除(-/-)小鼠。方法:将引进的SMS2杂合子(+/-)小鼠采用杂交、回交、互交的方法进行繁殖,一旦获得雄性和雌性SMS2纯合子(-/-)小鼠,便按照同样方法进行繁殖;用酚氯仿提取法提取小鼠基因组DNA,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型做出鉴定;将SMS2野生型(+/+)小鼠的产仔数作为正常对照组,与SMS2(+/-)和SMS2(-/-)小鼠的产仔数进行比较,用单因素方差分析、Dunnett检验处理数据。结果:SMS2(-/-)小鼠的饲养繁殖鉴定获得成功,单因素方差分析SMS2(+/+)小鼠、SMS2(+/-)小鼠以及SMS2(-/-)小鼠三组产仔数比较无显著性差异(P>0.05),Dunnett检验SMS2(+/-)小鼠与正常组比较产仔数无显著性差异(P>0.05),SMS2(-/-)小鼠与正常组比较产仔数无显著性差异(P>0.05)。结论:用正确的繁殖方法和鉴定方法可以成功获得SMS2(-/-)小鼠。

神经鞘磷脂在人胰腺癌细胞生长中的信使作用

目的：观察人胰腺癌细胞株中SM水平：观察PACAP138对人胰腺癌细胞株（HS766T）SM水平的影响。探讨SM在信息传导中的作用：同时观察SM的分解产物SPH对细胞的增殖作用及其机制。方法：细胞培养，分别加入不同浓度的PACAP138、PACAP638和SPH。应用MTT法来观察细胞增殖程度：Fura-2/AM测定[Ca^2+]；薄层层析法测定细胞内SM含量。结果：PACAP138促进HS766T的Ca^2+和SM的生成，呈剂量依赖性，PACAP638拮抗PACAP138的上述作用。SPH促进HS766T的生长，促进HS766Ta^2+和SM的生成，呈剂量依赖性，结论：SPH能促进人胰腺癌细胞株增殖；SM的信使作用一方面是通过与PI转换，活化PKC，产生IP3，另一方面是通过刺激Ca^2+转运和Ca^2+的释放。

神经鞘磷脂合成酶2基因敲除小鼠海马神经细胞自噬现象

目的利用神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)基因敲除小鼠探讨神经酰胺对海马神经细胞自噬现象的影响。方法将SMS2杂合子(SMS2+/-)小鼠采用杂交、回交、互交的方法进行繁殖,用酚-氯仿提取法提取小鼠基因组DNA,PCR扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定,建立纯合子(SMS2-/-)小鼠模型;采用透射电子显微镜、免疫荧光染色及Western blotting技术观察生后第7天(P7)、P14和P30 SMS2-/-小鼠海马CA1区神经细胞自噬的发生(每种方法每个时间点8只小鼠)。结果 1.SMS2-/-小鼠海马CA1区神经细胞自噬现象:电子显微镜下,模型组海马神经元内出现较多自噬体或自噬溶酶体样结构。光镜下,模型组P7、P14和P30 CA1区神经元自噬细胞数较对照组高(P<0.01);2.自噬相关蛋白Beclin-1对于自噬的调节作用:Beclin-1在模型组与对照组间的表达规律与微管相关蛋白1轻链3(MAPLC3)基本一致,P7、P14、P30模型组Beclin-1阳性细胞数明显多于对照组(P<0.01)。Beclin-1与MAPLC3两者在同一细胞中基本呈重叠表达;3.Western blotting检测各组海马CA1区神经细胞MAPLC3蛋白的相对表达量与上述结果一致。结论 SMS2-/-小鼠海马神经细胞内神经酰胺增高,神经酰胺不仅促进细胞凋亡,同时促进自噬,造成小鼠海马神经细胞自噬现象增强。

酒精对PC12细胞凋亡及中性神经鞘磷脂酶表达及活性的影响

采用不同浓度酒精处理PC12细胞,观察酒精诱导细胞凋亡作用及凋亡过程中中性神经鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase,N-S Mase)活性及mRNA表达量的改变.结果显示,当酒精浓度达50 mmol/L以上时,作用24 h后,去血清培养的PC12细胞表现出较强的细胞增殖抑制作用(P<0.05)并呈浓度依赖性.Hoechst 33258荧光染色结果显示处理组凋亡细胞增多,表现染色质凝集、细胞核变小、核碎裂成碎片等典型细胞凋亡特征性变化.琼脂糖凝胶电泳显示酒精处理组有不同程度的DNA断裂,呈凋亡细胞典型的梯状DNA.RT-PCR结果显示,不同浓度酒精作用PC12细胞2 h后N-S Mase表达升高.荧光分光光度法检测N-SMase的活性,显示酒精作用PC12细胞2h后酶活性升高,与去血清对照组相比差异显著(P<0.05).上述结果表明,酒精可导致PC12细胞凋亡并伴有N-SMase mRNA表达量增高,酶活性增强,说明酒精诱导PC12细胞凋亡与鞘磷脂循环有关.

尼曼-匹克病(神经鞘磷脂病)B型1例

患者女,12岁.于2001年5月无明显诱因出现面黄乏力,皮肤散在瘀点瘀斑,就诊于当地医院,查血常规全血细胞减少,间有胃痛、恶心、呕吐等症状.于10月来我院就诊.

神经鞘磷脂合成酶2基因沉默对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)基因沉默对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响以及机制分析。方法体外培养MCF-7细胞,分别转染siRNA control(SiR-Con)和SMS2 siRNA(SiR2),用MTT法筛选肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导MCF-7细胞凋亡的剂量(IC50)、采用薄层层析法(TLC)检测SMS2基因沉默后MCF-7细胞内SMS酶活性水平并用Hoechst 33258/PI染色法检测细胞凋亡情况。采用qRT-PCR和Western blot检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化。结果随着TNF-α(50～800 ng/mL)浓度的增加,对MCF-7细胞增殖抑制率也逐渐增加,IC50为205.7 ng/mL。经TNF-α作用后,TNF-α组、SiR-Con组和SiR2组MCF-7细胞内SMS酶活性灰度值明显低于CTL组,且细胞凋亡率和坏死率均高于CTL组;以SiR2组细胞SMS酶活性为最低,凋亡率和坏死率为最高(P <0.05)。SiR2组细胞Bcl-2表达量低于其他3组,而Bax和caspase-3基因表达则高于其他3组(P <0.05)。结论 SMS2基因沉默可降低MCF-7细胞内SMS酶活性,通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,同时上调促凋亡基因Bax和caspase-3的表达,提高TNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

神经鞘磷脂的研究进展

目前国内外对蛋白质的研究较多,对脂类深入研究甚少,神经鞘磷脂是细胞膜上比重较多的脂类,参与细胞的增殖分化,调节炎症,改变膜的流动性、结构,与许多疾病的发生发展相关。神经鞘磷脂在国外的研究,有些方面已被多数文献证实,有些方面仍存在许多争议,国内鲜有相关报道,本文就神经鞘磷脂的研究进行综述。

神经鞘磷脂合成酶2缺乏对小鼠学习记忆能力的影响

目的:探讨神经鞘磷脂合成酶2缺乏对小鼠学习记忆能力的影响,方法:实验采用雄性的野生型小鼠(WT)和神经鞘磷脂酶合成酶2缺乏小鼠(KO),每组10只,采用Morris水迷宫实验进行7 d的定位航行试验检测,之后进行空间探索试验,以检测小鼠的学习记忆能力。结果:定位航行试验检测结果显示,两组小鼠找到平台的潜伏期、游泳距离均无显著性差异(P>0.05);空间探索试验检测结果显示,两组小鼠的目标象限滞留时间占总时间的百分比和小鼠穿越平台区的次数也无显著性差异(P>0.05);但野生型小鼠的搜索策略优于神经鞘磷脂合成酶2缺乏小鼠(P<0.05)。结论:神经鞘磷脂合成酶2缺乏影响小鼠的搜索策略,但不影响小鼠的空间学习记忆能力。

神经鞘磷脂合成酶2与阿霉素致乳腺癌细胞线粒体损伤的相关性

目的:探讨神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)的表达与阿霉素(ADR)致乳腺癌细胞线粒体损伤的相关性.方法:采用过表达慢病毒感染法构建并筛选SMS2过表达的乳腺癌MCF-7细胞.CCK-8实验检测细胞对ADR的IC50值,选择适当浓度的ADR药物作用条件处理细胞后,使用MitoSOX试剂染色检测线粒体ROS水平,检测细胞内ATP水平以评估线粒体功能;电镜观察线粒体超微结构的异同;Western blot检测线粒体细胞色素C的释放水平和细胞凋亡相关蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax表达水平.结果:SMS2过表达的MCF-7细胞对ADR的IC50值为(2.42±0.073)μmol/L,而对照组细胞IC50值为(0.62±0.036)μmol/L(P<0.01).2μmol/L ADR处理细胞24 h后,SMS2过表达的MCF-7细胞内线粒体ROS水平降低(P<0.05);细胞内ATP水平增加(P<0.05);电镜观察示线粒体结构性损伤减轻;线粒体细胞色素C的释放水平降低(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3、Bax的表达减少(P<0.05).结论:SMS2过表达可能通过减轻ADR对乳腺癌MCF-7细胞线粒体的损伤作用,进而抑制细胞凋亡.