植物提取剂福司柯林对心房钠尿肽分泌的调节作用

目的:观察从植物中提取的腺苷酸环化酶直接激活剂——福司柯林对心房钠尿肽分泌的影响及其机制。方法:实验于2004-09/2005-09在吉林省延边大学医学部基础医学院生理学与病理生理学教研部完成。取大耳白兔26只,麻醉后立即开胸取出心脏,剥离左心房后固定心房灌流装置上,并给予适宜的电刺激使其搏动。利用体外灌流搏动的家兔心房做以下实验:①待心房搏动稳定之后,经过一个对照组循环(每12min定为一个实验循环),处理福司柯林(1μmol/L)3个循环。②经过一个循环对照组之后,先处理L-型Ca2+通道阻断剂硝苯地平(1μmol/L)或蛋白激酶非选择性抑制剂stau-rosporine(1μmol/L)3个循环,在硝苯地平或staurosporine存在下再处理福司柯林追加3个循环。以上实验均采用放射免疫技术和实时测定环-磷酸腺苷方法观察福司柯林对心房搏出量、环-磷酸腺苷逸出量及心房钠尿肽分泌的影响。结果:①福司柯林(1μmol/L)明显抑制心房钠尿肽分泌(P<0.01),同时显著增加心房搏出量和环-磷酸腺苷逸出量(P<0.01);在一定范围内,环-磷酸腺苷生成越多心房钠尿肽分泌越受抑制,并呈现线性关系(Y=-5.268X+9.506,r2=0.971,P<0.001)。②硝苯地平(1μmol/L)未能改变福司柯林对心房钠尿肽分泌的抑制和促进环-磷酸腺苷的生成效应(P<0.01),但显著抑制心房搏出量(P<0.01)。③staurosporine+福司柯林明显增加环-磷酸腺苷逸出量(P<0.01)的同时显著抑制心房钠尿肽的分泌(P<0.01),但心房搏出量并没有受到环-磷酸腺苷生成增多的影响,且心房钠尿肽的分泌与staurosporine(第3个循环)相比并没有显著性差异。结论:腺苷酸环化酶直接激活剂福司柯林主要通过蛋白激酶-依赖的信号转导途径抑制心房钠尿肽分泌。

胞内cAMP浓度的增加可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的 :探讨胞内cAMP浓度的增加与骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞的关系。方法 :采用Ficoll-Paque液 (1 0 77g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,采用含腺苷酸环化酶激动剂Forskolin及磷脂酶抑制剂 3-异丁基 - 1 -甲基黄嘌呤 (IBMX)的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 5× 1 0 5,1 0代可获得 2× 1 0 1 0 个细胞。加入Forskolin、IBMX以及两者联用诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ,呈典型神经元样形态 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF -M表达阳性 ,GFAP阴性。结论

PCNA、Survivin蛋白在人绒癌细胞株BeWo合体化过程中表达变化的研究

目的:通过检测人绒癌细胞株Be Wo合体化过程中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、生存素(Survivin)蛋白表达的变化,探讨滋养细胞合体化后增殖性的变化,为恶性滋养细胞肿瘤,尤其是耐药恶性滋养细胞肿瘤的临床治疗提供新的思路和方法。方法:利用毛喉素(forskolin)诱导Be Wo细胞株融合;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测促融素(Syncytin)在forskolin作用不同时间的Be Wo细胞株中的表达;应用蛋白质印迹(Western blotting)检测PCNA、Survivin蛋白在forskolin作用不同时间的Be Wo细胞株中的表达;应用噻唑蓝比色分析实验(MTT)法检测forskolin作用不同时间的绒癌细胞株Be Wo的增殖能力。结果:1forskolin作用后的Be Wo细胞株Syncytin基因的表达增强,且随着forskolin作用时间的延长,Syncytin的表达更强,于48 h达到高峰。2forskolin作用后的Be Wo细胞株PCNA、Survivin蛋白的表达降低。3forskolin作用后的Be Wo细胞株的增殖能力下降,且不同作用时间的差异有统计学意义;forskolin作用的时间越长,Be Wo细胞株增殖能力下降越明显。结论:人绒癌细胞株Be Wo合体化后PCNA、Survivin蛋白的表达降低,说明人绒癌细胞株Be Wo合体化后增殖性降低,推测诱导滋养细胞合体化可能对临床治疗恶性滋养细胞肿瘤具有一定作用。

丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路对猪卵巢颗粒细胞分泌功能的调节作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路对猪卵巢颗粒细胞分泌功能的调节作用。方法将体外培养的猪卵巢颗粒细胞分为两组，分别加入浓度为50μmo／／L的二甲基亚砜（DMSO）和MAPK抑制剂——PD98059（PD），作用48h后，将加入DMSO的细胞分为两组，观察1组细胞加入浓度为20μmol／L的腺苷酸环化酶激活剂，不加腺苷酸环化酶激活剂的为对照1组；将加入PD的细胞也分为两组，观察2组细胞加入浓度为20μmol／L的腺苷酸环化酶激活剂，不加腺苷酸环化酶激活剂的为对照2组，继续作用48h。以化学发光法测定4组细胞中睾酮、孕酮和雌二醇的水平；用RT-PCR技术检测17α羟化酶（CYP17）和细胞色素芳香酶P450的基因表达，以扩增产物的灰度比（GSR）表示。结果（1）生殖激素水平：对照1组睾酮、孕酮、雌二醇水平分别为（29．5±2．5）nmol／L、（80±5）nmol／L、（49±4）pmol／L，对照2组分别为（42．3±3．4）nmol／L、（170±15）nmol／L、（75±6）pmol／L，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；观察2组睾酮、孕酮、雌二醇水平分别为（106．2±7．6）nmol／L、（210±16）nmol／L、（130±11）pmol／L，观察1组分别为（47．2±3．5）nmol／L、（130±6）nmol／L、（81±6）pmol／L，两组比较，差异也有统计学意义（P〈0．05）；（2）酶表达变化：对照2组与对照1组比较，CYP17mRNA表达增强50％，而芳香酶P450mRNA表达下降20％，观察2组与观察1组比较，芳香酶P450、CYP17mRNA表达均增强，且以CYP17mRNA表达增强更明显，达到125％。结论MAPK信号传导通路对猪卵巢颗粒细胞的分泌功能具有抑制作用。

兔原始生殖细胞(PGCs)体外培养和生物学特性

为了探究兔原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)体外培养的生物学特性及胎龄、维甲酸(retinoic acid RA)、福司柯林(forskolin, FK)、4-羟基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen, 4OHT)、血清(FBS)和血清替代物(KSR)对PGCs分离培养的影响,本试验从E10.5~E15.5的胎兔生殖嵴中分离PGCs,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AKP)染色、RT-PCR等方法对其进行鉴定。在基础培养液中分别添加RA、FK、4OHT、FBS和KSR,结果表明,兔PGCs可以重编程为生殖干细胞(embryonic germ cells, EGCs),EGCs可分化为神经样细胞、上皮样细胞和拟胚体;从E10.5和E11.5的胎兔生殖嵴中分离的PGCs,体外培养增殖能力较强;基础培养液中同时添加RA、FK和4OHT时PGCs的集落数量较多,形态特征和细胞活性较好;培养液中加入KSR时,PGCs集落数量较多,形态特征较好。