二代测序建库中福尔马林固定石蜡包埋标本DNA超声打断方法的优化效果观察

目的:分析24例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本DNA采用新的改良的超声打断方法得到的结果与原打断方法得到结果的一致性,进一步优化目前福尔马林固定石蜡包埋样本DNA超声打断方法。方法:收集广东省人民医院病理科2023年4—5月进行二代测序检测病例24例,建库过程中根据使用的打断方法不同分为两组,1组采用原DNA打断方法(打断条件为:稀释后样本转移入配套的microTUBE AFA Fiber Snap-Cap打断管),2组采用改良DNA打断方法(打断条件为:稀释后样本转移入一次性超声波核酸打断耗材),比较两组实验结果是否一致。结果:两组实验结果得到的插入片段大小均>150bp,符合二代测序实验需要,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在临床实践中,二代测序建库过程中采用新的福尔马林固定石蜡包埋标本DNA超声打断方法可以达到原方法的实验效果,且更加经济实惠,从而能降低二代测序实验成本,值得在临床应用。

二代测序建库中福尔马林固定石蜡包埋标本DNA超声波打断的方法

二代测序(next generation sequencing,NGS)可以利用少量样本获得多基因多位点的突变信息,为患者选择合适的靶向治疗^([1])。目前比较多试剂盒使用的杂交捕获法建库流程首先需要将待测序的DNA分子用超声波打碎成200~500 bp长的片段,短的DNA片段有利于进行DNA分子快速杂交和高灵敏目标基因检测。本实验应用Covaris M220超声波打断仪对福尔马林固定石蜡包埋标本(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)DNA进行破碎,得到比较满意的结果,现介绍如下。

福尔马林致痛对大鼠行为学及脊髓NO、Fos的影响

目的 探讨大鼠福尔马林致痛的可能机制。方法 雄性 SD大鼠 64只 ,随机分为对照组 ( NS组、福尔马林对照组 )和实验组 ( L a F组、L n F组 )。 NS组为正常对照组 ,L a F组、L n F组在同福尔马林对照组处理前分别给予 L -精氨酸 ( L - Arg) ,L - NG-硝基精氨酸甲酯 ( L - NAME)鞘内注射 ,在福尔马林处理后 1/ 2 h、0～ 1h分别检测大鼠脊髓 NOS及 Fos的表达及观察大鼠的行为学表现。结果 福尔马林对照组的缩腿舔爪时间长于 NS组、脊髓的NOS及 Fos表达显著强于 NS组 ,预先给予 L - Arg或 L - NAME分别能加强或抑制以上作用。结论 福尔马林致痛能引起大鼠脊髓背角 NO的释放 ,诱导

曲马多鞘内预注对大鼠足底皮下注射福尔马林的超前镇痛效应

目的:观察鞘内预注曲马多对大鼠足底注射福尔马林后伤害性效应的影响,探讨曲马多在脊髓水平的超前镇痛效应。方法:64只W istar大鼠蛛网膜下腔埋入导管并长期留置,实验时经导管将药物注入蛛网膜下腔;于大鼠左后爪掌心皮下注射2.5%福尔马林50μl建立伤害性动物模型。实验分为A、B两大组,A组于福尔马林注射前5m in给药;B组于福尔马林注射后15m in给药。A、B两组分别再分为四组(每组8只大鼠):即生理盐水组,曲马多1、5、10μg组;以大鼠福尔马林注射后第二期反应的疼痛行为观察指标,并进行Dubuisson&Dennis评分,观察注药后的反应。结果:无论在福尔马林注射前或后给药,曲马多均能产生量效、时效相关的抗伤害作用,ED50分别为:3.68μg和5.08μg;95%置信区间分别为(1.34,6.29)和(2.27,7.92)μg。福尔马林注射前鞘内注入5、10μg曲马多的抗伤害效应评分在福尔马林注射后的第35、40、45m in时低于福尔马林注射后鞘内注入相同剂量曲马多的评分(P<0.05)。结论:在脊髓水平,曲马多能产生量效、时效相关的抗伤害作用,且具有超前镇痛效应。

10%中性缓冲福尔马林配制中应注意的问题

10%中性缓冲福尔马林溶液（pH值7.2～7.4）是临床诊断及实验病理学中最常用的固定剂,具有较强的组织穿透能力,组织收缩小,固定均匀、稳定,能使组织硬化,保证HE制片的高质量;能更好的保持组织的抗原性,有利于免疫组织化学标记物的检测。

福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法

从在福尔马林长期保存的动物物标本中提取基因组DNA用于分子生物学研究一直是一个未得到彻底解决的难题。本文提出了一种从浸泡在福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取基因组DNA的新方法。取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量 ,用PBS溶液冲洗 ,放在灭菌的吸水纸上将其揩干 ,于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成 5 0mg的小块 ,放入PBS液浸泡 12～ 2 4h ;然后转入 70 %的乙醇中处理 12～ 2 4h。依次换入下列梯度酒精中处理 :80 %乙醇 ,2h ,重复一次 ;90 %乙醇 ,2h ,重复一次 ;95 %乙醇 ,2h ,重复一次 ;10 0 %乙醇 ,1h ,重复一次。然后将材料放入 1/ 2倍的PBS液中浸泡 12h ,其间更换一次溶液。提取方法参考Sambroock等人 (1989) ,加蛋白酶K的量按标准量 (10 0 μg/mL) ,在 5 0～ 5 6℃温浴 3～ 6h处理过程中 ,不断轻摇混匀 ,视消化效果可以重复加入标准量的 1/ 2倍蛋白酶K进行消化 ,直至将材料完全消化为止 ;酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析 ;沉淀DNA时 ,在 - 2 0℃下 2 0min效果为宜。该方法主要特点在于对标本进行预处理 ,在保证不使DNA进一步降解的前提下 ,首先去除标本中所含的福尔马林溶液的成分 ,然后利用改进的酚氯仿抽提法提取该类标本的基因组DNA 。

福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析

福尔马林固定云南鲴的ＤＮＡ提取及其细胞色素ｂ基因序列分析ＤＮＡＥＸＴＲＡＣＴＥＤＦＲＯＭＦＯＲＭＡＬＩＮ－ＦＩＸＥＤＸｅｎｏｃｙｐｒｉｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＡＮＤＳＥＱＵＥＮＣＥＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＩＴＳＣＹＴＯＣＨＲＯＭＥＢＧＥＮＥ关键词福尔马林...

口服福尔马林对羔羊和成年母羊采食与消化代谢的影响

给饲喂精料型日粮的羔羊(体重分别为14.3和24.1 kg,n=3)和粗料型日粮的母羊(体重54.3 kg,n=5)口服福尔马林,以研究口服福尔马林对绵羊采食和消化代谢的影响。结果表明:口服福尔马林使单只羔羊的日采食量分别从(929.0±108.8),(1 124.8±155.9)g增加到(1 329.2±269.0),(1 701.1±465.9)g,单只母羊的日采食量从(1 632.3±118.3)g增加到(1 746.4±201.2)g;羔羊的氮保留分别从(16.01±2.87),(16.33±3.64)g/d,增至(21.45±0.24),(25.05±1.40)g/d;母羊的氮保留从(9.39±3.02)g/d增至(12.82±2.70)g/d。羔羊的日增重分别从(207.6±30.3),(204.5±2.3)g/d,提高到(328.8±78.3),(310.6±34.7)g/d;母羊的日增重从(75.0±15.3)g/d提高到(92.5±24.4)g/d。但口服福尔马林并不显著影响绵羊对日粮的消化率。本研究表明,口服福尔马林可大幅提高绵羊的生产性能。

福尔马林固定鱼类标本DNA提取方法的优化

气候变化和人类活动胁迫致使许多海洋鱼类种群结构发生了显著变化。为了摸清鱼类种群结构对气候变化和人类胁迫活动的响应机理,利用福尔马林固定标本研究较早年代海洋鱼类DNA是一种有效的途径。为了解决福尔马林固定鱼类样本DNA提取质量差的难题,以福尔马林固定近50年的金线鱼(Nemipterus virgatus)标本为例,研究DNA提取过程中多个因素对DNA提取产量的影响。以取样部位、除甲醛处理、消化时间、抽提方法为考察因素,以DNA提取浓度为评价指标,通过SPSS软件设计L8(4×24)正交实验。结果,得到的最优处理组为:肌肉组织样品经GTE缓冲液浸泡与酒精梯度处理后,90℃水浴30 min,真空干燥处理,加入裂解液与蛋白酶K,55℃水浴消化3 h,试剂盒法提取DNA。除甲醛处理是提高DNA产量的关键,处理步骤越多效果越好。90℃水浴后再消化能够显著提高DNA提取效率。通过对比标本DNA与新鲜样品DNA,PCR扩增的结果,证明使用优化方法提取的DNA能够满足后续研究的需求。

口服福尔马林对羔羊消化代谢与生长的影响

将8只30日龄、体重(6.9±1.0)kg的小尾寒羊×无角陶赛特母羔羊随机分为2组(每组4只),以研究口服福尔马林对羔羊自由采食、消化代谢、屠宰性能和甲醛残留的影响。结果表明,在55～80、95～120和125～150日龄3个日龄段,对照组羔羊的干物质采食量分别为(567.3±27.5)、(752.4±9.01)和(1044.1±30.8)g/(d.头),口服福尔马林组分别增加22.02%(P<0.01)、28.75%(P<0.01)和41.79%(P<0.01);对照组羔羊的氮保留分别为(12.3±0.8)、(13.6±0.2)和(18.0±0.6)g/(d.头),口服福尔马林组分别增加25.20%(P<0.01)、41.91%(P<0.01)和46.11%(P<0.01);对照组羔羊的日增重分别为(157.1±11.7)、(246.4±24.4)和(250.0±8.3)g/(d.头),口服福尔马林组分别增加18.20%(P<0.05)、23.21%(P<0.05)和27.16%(P<0.01);而两组间的日粮消化率无显著差异。240日龄对照组和口服福尔马林组羔羊的胴体重分别为(20.37±1.78)和(24.55±1.14)kg/头(P<0.01),屠宰率分别为48.59%±1.08%和50.46%±1.02%(P<0.05),瘦肉率分别为65.22%±1.57%和64.84%±1.11%(P>0.05)。羔羊血液、肌肉、肾脏、肝脏、瘤胃组织和小肠组织中的甲醛含量对照组分别为(1.84±0.44)mg/L、(0.35±0.26)mg/kg、(1.10±0.67)mg/kg、(0.74±0.34)mg/kg、(0.91±0.72)mg/kg和(0.79±0.41)mg/kg,在试验组分别为(1.47±0.61)mg/L、(0.54±0.34)mg/kg、(1.65±0.71)mg/kg、(0.91±0.38)mg/kg、(2.03±0.71)mg/L和(0.85±0.42)mg/L。因此,口服福尔马林可增加羔羊的自由采食量而不影响消化率,提高羔羊对日粮的消化量和羔羊日增重;以上这种作用随羔羊的日龄增加而增强;口服福尔马林提高羔羊的胴体重、屠宰率,但不影响胴体的瘦肉率;长期口服福尔马林羔羊的组织器官中甲醛的含量低于2.0 mg/kg。

粗料型日粮条件下口服福尔马林对小尾寒羊成母羊消化代谢的影响

本试验选取6只装置永久性十二指肠和回肠瘘管、体重约55 kg的成年小尾寒羊母羊,按0(对照期)或0.9 mL/kg日粮(试验期)喂给福尔马林(各期n=6),收集十二指肠和回肠食糜,并进行消化代谢试验,以研究在粗料型日粮条件下口服福尔马林对绵羊消化代谢的影响。结果表明,口服福尔马林使绵羊的自由采食量增加13.0%(P<0.01);前胃有机物(OM)和纤维素(Cel)的消化量分别增加21.9%(P<0.01)和29.7%(P<0.01);到达小肠的OM、粗蛋白质(CP)、微生物蛋白、过瘤胃蛋白、总氨基酸(TAA)和赖氨酸(Lys)量分别增加5.2%(P<0.01)、21.5%(P<0.01)、13.2%(P<0.05)、29.4%(P<0.05)、18.0%(P<0.05)和21.8%(P<0.05);小肠消化吸收的OM、CP、TAA和Lys量分别增加52.1%(P<0.01)、34.7%(P<0.01)、34.5%(P<0.05)和32.8%(P>0.05);日粮DM、OM、CP和Cel的(表观)消化率分别提高9.2%(P<0.05)、9.2%(P<0.05)、4.6%(P<0.05)和5.8%(P<0.05);氮、钙和磷保留量分别增加了28.3%(P<0.01)、30.8%(P<0.01)和9.5%(P<0.05)。因此,在粗料型日粮条件下绵羊口服福尔马林可以提高瘤胃消化能力、提高采食量、增加小肠营养物质特别是氨基酸的消化吸收量、显著改善机体的营养状况。

口服福尔马林对绵羊瘤胃微生物群落和瘤胃代谢的影响

选取4只1.5岁龄,体重约45kg,装置了永久性瘤胃瘘管的小尾寒羊公羊,研究两种日粮条件下口服福尔马林(0.9mL/kg日粮,干物质计)对绵羊瘤胃微生物区系和代谢的影响。结果表明,粗料型日粮条件下,对照期和试验期绵羊自由采食量分别为(1188.9±168.3),(1520.3±245.1)g/d(P<0.01);瘤胃液原虫总数分别为(8.24×105±1.74×105),(5.75×105±0.64×105)CFU/mL(P<0.05);细菌总数分别为(127.20×109±13.40×109),(181.10×109±38.10×109)CFU/mL(P<0.05);总挥发脂肪酸分别为(78.60±3.50),(89.60±4.95)mmol/L(P<0.05);氨态氮浓度分别为(20.70±10.70),(16.10±8.84)mg/100mL(P<0.05);甲醛浓度分别为(23.00±1.80),(41.00±1.46)mg/L(P<0.01)。精料型日粮条件下,对照期和试验期绵羊自由采食量分别为(2037.1±299.3),(2160.5±437.6)g/d(P>0.05);瘤胃液原虫总数分别为(12.40×105±2.61×105),(5.63×105±1.87×105)CFU/mL(P<0.05);细菌总数分别为(120.70×109±25.20×109)CFU/mL,(196.30×109±78.90×109)CFU/mL(P<0.05);总挥发性酸分别为(112.90±5.78),(117.20±3.09)mmol/L(P>0.05);氨态氮浓度分别为(14.30±1.44),(14.3±2.05)mg/100mL(P>0.05);甲醛浓度分别为(23.33±1.38),(32.70±2.88)mg/L(P<0.05)。研究表明,绵羊口服福尔马林(0.9mL/kg日粮)后自由采食量增加,瘤胃液原虫数量减少,但细菌总数增加(除大杆菌外);绵羊口服福尔马林后提高瘤胃液挥发性脂肪酸浓度和降低氨态氮浓度的作用方面粗料型日粮强于精料型日粮;绵羊瘤胃中天然有甲醛存在,绵羊口服福尔马林后则浓度升高。

氧化槐定碱对福尔马林致痛小鼠大脑GAT-1表达的影响

目的观察小鼠大脑GABA转运体1(GABA transporter-1,GAT-1)的变化对氧化槐定碱(oxysophoridine,OSR)镇痛作用的影响。方法采用福尔马林舔足法观察小鼠静脉(intravenous injection,iv)给药后OSR的镇痛效果,免疫组织化学方法(SABC法)观察OSR对小鼠大脑皮层和丘脑GAT-1免疫阳性细胞的影响,Real time RT-PCR方法检测OSR对福尔马林致痛小鼠大脑GAT-1 mRNA表达的影响。结果 iv OSR 500、250、125 mg·kg^(-1)可延长福尔马林所致小鼠的舔足潜伏期(P<0.05,P<0.01);腹腔注射(intraperitoneal,ip)OSR 500 mg·kg^(-1)可使小鼠丘脑和大脑皮层的GAT-1免疫阳性细胞表达明显减少(P<0.01),对小鼠大脑的GAT-1mRNA的表达也有明显的抑制作用(P<0.05)。结论 OSR有明显的镇痛作用,其镇痛作用机制与中枢GAT-1表达的下调相关。

大鼠福尔马林实验中脊髓后角浅层内P物质和降钙素基因相关肽的变化

为研究福尔马林实验动物行为反应与脊髓内Ｐ物质（ＳＰ）和降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）之间可能的相互关系，应用免疫组织化学方法结合图像分析技术，对福尔马林实验大鼠不同时程的脊髓后角浅层内ＳＰ、ＣＧＲＰ的含量进行了半定量分析，并与大鼠的行为反应分期进行了比较。结果显示：脊髓后角浅层内ＳＰ和ＣＧＲＰ的含量在福尔马林实验后的第１期反应（０～５ｍｉｎ）时迅速降低；在间歇期（５～２０ｍｉｎ）仍持续降低，在１５ｍｉｎ达最低值；间歇期后进入第２期反应（３０～６０ｍｉｎ）时，逐渐开始缓慢恢复，６０ｍｉｎ后恢复至正常水平，并开始逐渐增高，于９０ｍｉｎ达最高值。之后逐渐回落，在１２～２４ｈ又恢复至正常水平。

口服福尔马林对绵羊瘤胃消化代谢的影响

本试验选取4只体重约35 kg、2岁龄装置了永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的新疆美利奴羯羊,采用4×4拉丁方设计,研究口服福尔马林对饲喂玉米秸秆日粮绵羊瘤胃消化代谢的影响。结果表明,给绵羊分别喂给0(对照)、0.5、1.0、1.5m l/d.只福尔马林,各处理组羊的玉米秸秆采食量分别为637.1、692.9、744.8和760.3 g/d.只,瘤胃液氨态氮平均浓度分别为26.1、24.4、23.6和21.8 m g/100 m l,乙酸平均浓度分别为64.92、65.21、66.17和66.46 mm o l/L,丙酸平均浓度分别为15.29、16.21、17.61和17.98 mm o l/L,丁酸平均浓度分别为10.43、10.64、11.30和11.52 mm o l/L,总VFA平均浓度分别为90.64、92.06、94.66和95.95 mm o l/L,原虫平均数量分别为71.7、52.9、47.5和40.3(×104个/m l)。前胃有机物消失量分别为510.1、594.1、628.3和634.4 g/d.只,前胃纤维素消化率分别为53.1%、61.1%、66.2%和64.5%,到达十二指肠的粗蛋白质量分别为82.3、87.3、96.1和97.8 g/d.只,微生物蛋白质量分别为64.8、64.6、61.3和60.2 g/d.只,过瘤胃饲料蛋白质量分别为16.1、20.5、32.9和35.6 g/d.只。试验结果表明,给绵羊口服福尔马林可提高动物对玉米秸秆的采食量,降低瘤胃液氨态氮的浓度,具有增加乙酸和丙酸浓度从而增加总挥发性脂肪酸浓度的趋势,增加前胃有机物的消失量和纤维素的消化量,增加到达十二指肠的粗蛋白质总量和过瘤胃饲料蛋白质量,并有减少到达十二指肠的微生物蛋白质量的趋势。福尔马林以上这些作用均随剂量的增加而提高,然而,从总体看,绵羊每天口服1 m l福尔马林(分2次喂给)比较适于改善瘤胃消化代谢状况。

福尔马林保存鱼类标本中大片段DNA的提取

从福尔马林保存的鱼类标本中获得高质量DNA是比较困难的。我们对前人的方法进行了如下改进:1)在标本的前处理过程中,通过长时间的缓冲液浸泡、短暂的加温、真空干燥来消除福尔马林对样品的影响;2)在样品消化过程中,加入相对过量的蛋白酶K和还原剂;3)提取DNA后立即进行PCR反应,并增加反应的循环次数和提高退火温度。通过这些改进,我们成功地从福尔马林保存的鱼类标本中提取出了高质量DNA;通过对比不同方法(福尔马林、酒精及冰冻)处理过的标本的DNA测序结果,表明该方法是值得信赖的;标本从死亡到用福尔马林处理之间的时间延搁可能是影响所提取的DNA质量的重要因素。

不同浓度福尔马林对兔疼痛反应和定量药物脑电图α_1频段的影响

目的观察不同浓度福尔马林对兔疼痛反应和定量药物脑电图α1频段的影响。方法成年大耳白兔18只,随机分为3组（n=6）,建立肌松兔模型后分别在右前肢足底皮下注射1%福尔马林（LD组）、8%福尔马林（HD组）或生理盐水（NS组）0.5ml。应用定量药物脑电图（quantitativepharmaco-EEG,QPEEG）,采用功率谱分析技术,观察注射前后兔QPEEGα1频段功率百分比的变化。另取家兔18只,随机分为3组（n=6）,清醒状态下采用上述注射方法建立炎症痛模型。观察兔伤害性行为反应并进行疼痛评分。结果HD组和LD组对福尔马林刺激伤害反应评分均大于NS组（P〈0.01,P〈0.01）,HD组大于LD组（P〈0.01）。与注射前相比,3组兔α1频段功率百分比均增加。HD组增加幅度最大（P〈0.01）,以左侧额、顶区变化最为明显。NS组引起的α1频段功率百分比增加幅度最小,且仅持续1-2min。结论福尔马林所致兔的疼痛反应及兔QPEEGα1频段功率百分比呈浓度依赖性增加,提示α1频段功率百分比有可能成为反映镇痛程度的指标。

福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA提取

由于甲醛介导的DNA损伤和石蜡对DNA提取的阻碍作用,使得常规DNA提取方法很难从福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)中获取高质量的DNA。近年来,众多学者的研究表明,通过改良预处理方法,优化蛋白酶K消化作用,简化DNA提取步骤,纯化DNA提取物等,可以有效提高FFPET中提取的DNA质量,为FFPET的DNA分析奠定了基础。

c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽 A表达的研究(英文)

本研究通过鞘内注射 c-fos反义寡聚脱氧核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中 F os蛋白的表达 ,观察了 Fos蛋白合成和慢痛反应的关系 ,并分析 Fos蛋白合成和强啡肽 A(Dyn A)表达之间的关系。实验组动物 (n=5 )鞘内预先注射 c-fos的 AS-ODN(5 0μg,5μl) ,另两个对照组 (每组 n=5 )分别注射等量生理盐水和 AS-ODN的反序核苷酸 (reverseoligodeoxynucleotides,RS-ODN,5 0μg,5μl) ;4h后 ,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射 formalin(5 % ,5 0μl) ,并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法 ,检测大鼠的伤害性行为反应 ,行为检测后 1h处死动物 ,用免疫组化方法检查脊髓背角中 Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽 A(1～ 8)的表达量。结果发现 ,和两个对照组相比 ,实验组动物 Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱 ,同时 Form alin注射侧背角 F os蛋白样免疫阳性细胞的数量和 Dyn A含量的灰度值明显减少。本研究结果提示 ,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以 c-fos基因表达增加及受其调控的 Dyn A表达上调为基础的 ,由此推测在脊髓背角神经元中 Fos蛋白和 Dyn