适配体识别-化学发光技术检测福氏志贺菌

福氏志贺菌(Shigella flexneri)是一种危害人类健康的食源性致病菌。该实验首先制备鲁米诺功能化花状纳米金和氨基化磁性纳米Fe_(3)O_(4),然后将福氏志贺菌适配体的互补序列(FSZ-2HH)连接在鲁米诺功能化花状纳米金的表面构建信号探针,并将福氏志贺菌适配体(FSZ-1)通过亲和素的桥接作用修饰到氨基化磁性纳米Fe_(3)O_(4)表面构建捕获探针。当目标物存在时,目标物和信号探针会竞争性结合捕获探针,进而通过测定化学发光来达到检测目的。实验结果表明:在浓度2.6×10~2.6×10^(5) CFU/mL,福氏志贺菌的浓度与化学发光强度呈良好的线性关系,检出限为12 CFU/mL,特异性良好。该实验建立的方法为食品中福氏志贺菌的快速高灵敏检测提供了良好思路。

免疫磁分离及免疫比浊分析对福氏志贺菌的自动快速定量检测

目的以SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌分别与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备福氏志贺菌特异的多抗磁珠和抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂,利用免疫比浊分析探索其在福氏志贺菌自动快速定量检测中的初步应用。方法福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔制备多抗血清,磁珠包被SPA后再与多抗偶联,制成多抗免疫磁珠。以该磁珠捕获模拟标本的福氏志贺菌,接种MH平板37℃培养18～24h,菌落计数后计算免疫磁珠的特异富集作用。富含SPA的金黄色葡萄球菌(No1800株)经甲醛灭活后,与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备特异抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在日立7060全自动生化分析仪编制程序进行自动检测并进行初步的方法学评价。结果福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔获得了高质量的多抗血清,特异性好,凝集效价达1∶320;制备多抗免疫磁珠对福氏志贺菌具有一定的富集作用,菌落计数显示磁珠处理的细菌捕获效率约为30%;抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在玻片上能与待测福氏志贺菌产生明显的凝集现象,在日立7060全自动生化分析仪上定量检测灵敏、特异、线性良好。结论以福氏志贺菌的多抗血清分别致敏SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌,制备特异的多抗磁珠对福氏志贺菌有一定的特异捕获与富集作用,抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂对福氏志贺菌的自动、快速、定量检测具有较好的效果,为病原菌的快速诊断和自动定量分析提供了新的思路。

豪猪源福氏志贺菌的分离鉴定及喹诺酮类耐药基因检测

为调查四川省某规模化豪猪养殖场中豪猪大面积腹泻死亡的原因,本研究采集病死豪猪的肠道内容物和肺脏等病料样品进行细菌的分离纯化,通过培养特性观察、革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因的克隆测序进行鉴定,并对分离菌株进行致病性、耐药性分析,对其喹诺酮类耐药基因进行PCR检测并测序分析。结果显示,分离得到1株革兰阴性菌,该分离株符合福氏志贺菌的培养特性和生化特性,并且其16S rRNA基因序列与福氏志贺菌该基因序列的同源性为99%;对小鼠具有较强致病性;药敏试验结果显示分离株具有多重耐药性,仅对丁胺卡那敏感,对喹诺酮类、四环素类、头孢类、氨基糖苷类、青霉素类和氯霉素类药物均表现为耐药;分离株的DNA促旋酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ的喹诺酮耐药决定区均有突变,且携带有质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr A和qnr S。本研究是国内首次关于豪猪源福氏志贺菌病的报道,为豪猪养殖中该细菌性疾病的诊断防治等相关研究提供参考。

儿童福氏志贺菌TEM型β内酰胺酶耐药基因及其耐药性检测

目的了解儿童福氏志贺菌是否存在TEM基因及其发生率以及对耐药性的影响。方法对2004年6—11月从本院细菌性腹泻患儿粪便培养标本分离到的福氏志贺氏菌共51株,进行β内酰胺酶TEM全长基因PCR检测;用K-B法测定志贺菌对7种抗菌药物的敏感度。结果51株福氏志贺菌中17株检出TEM基因,阳性率33.3%;志贺菌对氨苄西林的耐药率高,其中TEM基因阳性志贺菌的耐药率为88.2%、TEM基因阴性志贺菌的耐药率为82.4%;对氨苄西林-舒巴坦也有一定的耐药,TEM基因阳性志贺菌、TEM基因阴性志贺菌的耐药率分别为41.2%、20.6%。结论从福氏志贺菌检出TEM型β内酰胺酶耐药基因,携带率为33.3%。

一种罕见的福氏志贺菌4c型流行菌株的鉴定分析

目的鉴定、分析新出现的福氏志贺菌4型流行菌株的表型和DNA型别特征。方法在部分测试典型菌株用生化、血清型别及药敏试验等的基础上结合R iboprinter DNA指纹图谱分析系统(RP)来分析鉴定测试菌。结果该类菌株表型符合志贺菌定义,血清学分型为福氏志贺菌4 c型(F4 c,Ⅳ:7,8);限制性内切酶EcoRⅠ的酶谱与RP数据库中志贺菌一致,PvuⅡ的酶切结果发现,参考菌株中有1株F2b地方株与F4 c酶谱一致。结论福氏志贺菌4 c型可能是F2b的溶源性变异菌株。应用RP双酶切福氏志贺菌具有分子鉴定和分子分型的作用。

福氏志贺菌IgY的抑菌作用

目的探讨口服福氏志贺菌IgY在动物体内的抑菌作用。方法以福氏志贺菌制备免疫原,免疫母鸡,收集鸡蛋,提取IgY。以不同剂量的IgY口服免疫6日龄乳鼠,并分别以不同剂量的福氏志贺菌于不同时间攻击,观察体内抑菌作用。结果攻菌前口服特异性IgY的乳鼠,其直肠内分离菌的百分率明显低于攻击后口服IgY的乳鼠。抑菌作用随着口服IgY剂量的减少和攻菌量的增加而降低。口服大于3mg/只的特异性IgY,可使肠内特异菌减少50%以上。口服4mg/只可抵御10亿菌的攻击。结论福氏志贺菌特异性IgY可有效抑制该菌在乳鼠肠内的繁殖。

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。

喹诺酮类耐药福氏志贺菌的质粒介导耐药机制研究

目的研究萘啶酸耐药的福氏志贺菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ib-cr的流行状况。方法收集我院2002-2011年腹泻患者大便标本分离出的福氏志贺菌,用纸片扩散法测定13种抗菌药物的敏感性,筛选出存活的82株萘啶酸耐药的野生株。采用PCR方法检测菌株的qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ib-cr耐药基因,对PCR阳性产物进行测序确定基因型别。结果 82株萘啶酸耐药的福氏志贺株以F2a最为常见,占47.56%,对其他多种抗生素存在耐药,耐药率分别为氨苄西林95.12%、哌拉西林18.29%、头孢噻肟12.20%、头孢曲松12.20%、头孢吡肟7.50%、环丙沙星53.66%、氧氟沙星37.80%、诺氟沙星36.59%、左氧氟沙星26.83%、头孢美唑4.00%、氯霉素40.24%、复方磺胺甲恶唑77.50%和磷霉素6.10%。共检测到质粒介导耐药基因的细菌13株(15.85%),3株携带qnrB基因均为qnrB6型;8株携带qnrS基因均为qnrS1型;7株携带aac(6')-Ib-cr基因,其中有5株同时携带qnrB和aac(6')-Ib-cr。结论本地区福氏志贺菌临床分离株对喹诺酮类抗菌药物耐药较严重,存在质粒介导的耐药机制,应加强监测。

福氏志贺菌感染豚鼠和HeLa细胞的毒力

目的 研究福氏志贺菌感染豚鼠和HeLa细胞后细菌致病能力的差异 ,探讨痢疾的防治。方法 选用 2 8株福氏志贺菌感染豚鼠眼角膜 ,观察角膜结膜病变反应 ,并进行细胞学、细菌学、病理组织切片检查。然后再选出12株福氏志贺菌强毒株和两株弱毒株 ,通过噬斑形成实验 ,观察对HeLa细胞的侵袭能力。结果 2 8株福氏志贺菌均在 3d之内引起豚鼠发病 ,但症状表现有差异 ,除 2株福氏志贺菌感染豚鼠后发病时间延长、症状轻微外 ,其余菌株则引起较为严重的角膜结膜炎 ,尤其在感染第 3天 ,出现最为典型的临床表现。噬斑形成试验结果与豚鼠感染试验基本相符。结论 检测福氏志贺菌的毒力可用HeLa细胞噬斑形成试验替代Sereny试验。利用Sereny试验和HeLa细胞噬斑形成试验鉴定出 2 6株福氏志贺菌的强毒株和 2株弱毒株 。

福氏志贺菌4C亚型生物学特性研究及ipaH基因检测

目的:了解福氏志贺菌4C亚型(F4c)的生物学特性及毒力情况。方法:以生化反应、噬菌体裂解试验、血清分型鉴定菌种;按K-B法进行药敏试验;采用PCR技术检测ipaH基因;同时观察对动物的侵袭力。结果:该菌型具有志贺菌属的基本特点,靛基质等试验传代后有变化,能被Ent噬菌体溶原化而出现型抗原变异现象,ipaH基因和动物侵袭力试验阳性,对四环素、TMP等耐药。结论:F4c是一个少见的血清型,生物学特性与F2a相近,一定条件下能出现型抗原和生化特性变异。

福氏志贺菌ipaC基因的克隆及序列分析

为了克隆福氏志贺氏菌的ipaC基因,以志贺氏菌福氏2a菌株为模板进行PCR,并将PCR产物插入到pMD T载体中,得到阳性重组子,并命名为pMD ipaC.测序结果显示,其核苷酸序列与文献报道的序列有差异,但编码的氨基酸序列相同,表明志贺氏菌的ipaC基因已被成功克隆.

福氏志贺菌PFGE和MLVA分子分型方法的应用与评价

目的比较和评价脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)和多位点可变数目串联重复序列分析技术(MLVA)在福建地区福氏志贺菌研究中的应用。方法运用PFGE和MLVA技术对43株分离自福建地区的福氏志贺菌进行分子分型,结合流行病学资料分析比较分型效果。结果 43株福氏志贺菌经PFGE分型后相似度在61.70%～100%之间,按照100%的相似水平可分为36个PFGE型,没有优势PFGE型别,分辨系数为0.992 2,存在4个优势簇(G1～G4);福氏志贺菌经MLVA分型后,按照100%的相似水平可分为41个MLVA型别,遗传关联度介于6.207%～100%之间,没有优势MLVA型别,分辨系数为0.997 8,得到5个优势基因群(Cluster1～5)。在最小生成树上,部分F4c与Fx亲缘关系较近,并都由F2a和F1a分支而来,表现出一定的遗传关系。结论两种分型方法的分辨率基本一致,PFGE分型结果与流行病学背景资料及血清型别基本吻合,MLVA在分析菌株种群进化关系上更具优势。

福氏志贺菌gyrA和parC基因QRDR序列的测定与同源性分析

测定了我国痢疾流行病原志贺菌福氏2 a 3 0 1株与喹喏酮类药物耐药性相关的 gyr A( DNA旋转酶 A亚单位 )和 par C(拓扑异构酶IVA亚单位 )基因 ,并将 gyr A和 par C基因QRDR(喹喏酮类药物耐药性决定区 )核苷酸序列与几种动物和人的病原菌进行了同源性和遗传进化比较分析。结果显示 ,志贺菌福氏 2 agyr A和 par C基因 QRDR序列分别与宋内氏志贺菌、大肠杆菌 O1 57、大肠杆菌 K1 2、阴沟肠杆菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎克氏杆菌、产道克氏杆菌、空肠弯曲杆菌、弗氏柠檬酸杆菌具有显著同源性(均大于 88% ) ,表明 gyr A和 par C是这些细菌中的看家基因 ,推测在各种细菌中具有类似的起源 ,因此对在不同细菌之间进行喹喏酮类药物耐药性的研究非常有利。 QRDR的遗传进化分析表明 ,同属或相近属细菌 gyr A或 par CQRDR的遗传距离明显接近 ,其中与大肠杆菌属的距离最近 ,认为可列到同一个属 ,结果有力支持了近年提出的大肠杆菌与志贺菌属于同族细菌的理论。

福氏志贺菌主动外排基因acrA的克隆及原核表达

目的对福氏志贺菌外排基因acrA进行克隆和原核表达,为进一步研究其在志贺菌外排机制中的作用奠定基础。方法参考福氏志贺菌2aacrA基因序列设计一对特异引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列。以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增acrA基因并与pMD18-T载体连接,然后转化DH5α。提取重组质粒pMD18-acrA,经BamHI/SalI双酶切并与载体pET30a连接后转化宿主菌BL21(DE3)pLys,通过IPTG诱导表达目的蛋白。结果克隆的acrA基因长度为1122bp,核苷酸序列与GenBank上公布的序列完全相同。原核表达经SDS-PAGE及WesternBlotting检测和鉴定,结果表明重组载体pET-30a-acrA可成功地在大肠杆菌中表达AcrA蛋白。结论成功构建了福氏志贺菌acrA基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,该研究为了解AcrA蛋白的特性、功能以及对福氏志贺菌多药耐药机理的深入研究奠定了基础。

VITEK MS质谱仪错误鉴定福氏志贺菌1例

目的了解VITEK MS对1株从血培养分离的福氏志贺菌的鉴定能力。方法采用VITEK MS、Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪、血清凝集试验及16S rRNA基因测序进行鉴定;采用VITEK MS分别对福氏志贺菌临床株、福氏志贺菌CMCC51572、大肠埃希菌ATCC8739进行质谱鉴定及蛋白质谱图比较分析。结果 VITEK MS鉴定为大肠埃希菌,可信度为99.9%;Vitek 2 Compact鉴定为志贺菌属,可信度为89.0%;血清学结果为福氏志贺菌3a型;16S rRNA基因测序为志贺菌、福氏志贺菌1a、福氏志贺菌2a、大肠埃希菌,序列同源性达97%以上;福氏志贺菌临床株、福氏志贺菌CMCC51572、大肠埃希菌ATCC8739的蛋白质谱图相似。结论志贺菌和大肠埃希菌在基因角度上符合同一个种,VITEK MS不能区分志贺菌和大肠埃希菌,需要附加生化反应、科玛嘉尿道定位显色培养及血清学试验进行志贺菌的排除。

一株福氏志贺菌中同时检出CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS

目的明确1株福氏志贺菌RJ506对第3代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的分子机制。方法通过E-test检测RJ506对各抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),接合试验了解耐药性是否由质粒介导;用聚合酶链反应(PCR)分别扩增染色体和质粒介导的喹诺酮耐药基因并进行序列分析,检测染色体介导耐药的突变位点和质粒介导耐药的基因型;用PCR扩增CTX-M各组超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因并进行序列分析,检测ESBLs的基因型。结果RJ506对头孢噻肟和环丙沙星同时耐药,其染色体DNA旋转酶gyrA亚基的83位发现Ser→Leu突变,而gyrB和parC未见突变;该菌株同时含有ESBLs基因blaCTX-M-3和喹诺酮耐药基因qnrS,且分别位于不同的可接合质粒上。结论本实验在国内的志贺菌中检出质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS和CTX-M-3型ESBLs。

福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法的建立及应用

目的建立福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法。方法根据福氏志贺菌4av和Yv血清型O抗结构,针对O抗合成基因wzx、IV型抗原决定基因gtrIV和MASF IV-1抗原决定基因opt,建立血清型4av和Yv的PCR鉴定方法。并应用该方法对126株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测。结果建立了一种福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,在一个反应中包括4对引物,Yv血清型PCR扩增为wzx及opt阳性;4av血清型PCR扩增为wzx、opt及gtrIV阳性。该方法可将4av和Yv血清型与目前已知的其他福氏志贺菌血清型完全区分。对126株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法具有很好的特异性。结论本研究建立的福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,可以用于志贺菌检测和监测。

一起福氏志贺菌2a亚型导致的细菌性痢疾暴发调查

目的对一起细菌性痢疾暴发进行流行病学调查,以查明疫情暴发的原因,为采取相应控制措施提供依据。方法建立病例定义,进行个案调查,描述病例的三间分布特点,并对疾病流行的地点开展卫生学调查,寻找导致疾病暴发流行的原因。结果共搜索到病例111例(罹患率为3.50%),喝生水是发病的危险因素。结论这是一次由水源与食源混合传播的福氏志贺氏2a亚型细菌性痢疾暴发,主要原因是侗族人群习惯饮用未经消毒的饮用水和卫生习惯不良。

福氏志贺菌临床分离株毒力基因的研究

目的研究在一种快速、特异的mPCR方法在检出福氏志贺菌的同时对其毒力进行监测。方法选取福氏志贺菌三种毒力基因ipaH,ial,set1B作为扩增目标,在同一mPCR体系中对86株福氏志贺菌临床分离株进行了检测,并选取12株进行了噬斑形成试验,观察了扩增产物不同的福氏志贺菌对Hela细胞的毒力作用。结果86株福氏志贺菌临床分离株均检测到ipaH基因,阳性率为100%;45株检测到ial基因,阳性率为52%;69株检测到set1B基因,阳性率为80%。噬斑形成试验证明,mPCR结果不同的菌株对Hela细胞的感染能力存在明显差异。结论应用上述mPCR体系在检出福氏志贺菌的同时能够对菌株的毒力进行初步判别,对于临床诊断及治疗具有重要意义。

鸡福氏志贺菌SHV-12型ESBLs基因的扩增、原核表达及酶特性研究

对5株鸡福氏志贺菌产SHV-12型ESBLs基因进行重组表达并优化表达条件,观察了表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶特性。结果表明:构建的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切后,可切下目的条带。重组质粒转化BL21后所表达的重组蛋白有超广谱β-内酰胺酶活性。SHV-12原核表达的最佳条件是IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度37℃、诱导时间5 h;SHV-12型ESBLs亲和力最强的底物是头孢噻呋钠,Km值为1.29μmol,较难水解的底物是头孢曲松钠,Km值为24.13μmol;它唑巴坦、舒巴坦对头孢曲松钠的抑酶保护率分别为21.01%、25.51%,对头孢噻呋钠的抑酶保护率分别为34.99%、35.49%。