福氏2a志贺菌301株染色质基因文库的构建

目的 构建福氏 2a志贺氏菌 3 0 1株染色质DNA基因文库 ,为下一步全基因组序列测定打下基础。方法 Murry法提取福氏 2a志贺氏菌染色质DNA ,采用鸟枪法策略 ,分别经 8种限制性内切酶消化后克隆至载体质粒中 ,并经双脱氧链末端终止法测序后计算重组质粒重复率。结果 Murry法提取福氏 2a志贺氏菌染色质DNA大小为 3 0Kb以上 ,共构建 86 3 2个重组质粒 ,质粒重复率为 1 %。结论 本研究在国际上首次成功构建了福氏 2a志贺氏菌株染色质DNA基因文库 ,文库全长为福氏 2a志贺氏染色质的 6倍 ,已足够全基因组序列测定所需。

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的:构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法:根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果:构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论:获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。

与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的:筛选、鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白,以进一步研究ArgT在福氏2a志贺氏菌致病过程中发挥的作用。方法:将ArgT与GST融合表达,通过体外GST沉降实验和MALDI-TOF MS技术,筛选并鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白。结果:筛选并鉴定到与福氏2a志贺氏菌2457T ArgT相互作用的蛋白OmpR。结论:OmpR与ArgT存在体外相互作用。

福氏2a志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因分型在菌痢快速诊断中的应用

目的对福氏2a志贺菌肠毒素ShET1(Shigellaenterotoxin1)和肠毒素ShET2(Shigellaenterotoxin2)进行基因分型,提高菌痢爆发流行时同源克隆的鉴定分析水平。方法对93株分离自不同地区,不同时间的福氏2a志贺菌用PCR法检测志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因,进行基因分型和同源克隆鉴定。结果93株福氏2a志贺菌按志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因可分为4种基因型,即12株ShET1(-)/ShET2(+),14株ShET1(+)/ShET2(-),59株ShET1(+)/ShET2(+),8株ShET1(-)/ShET2(-)。93株福氏2a志贺菌ShET1检出率为89.24%(83/93),ShET2为65.59%(61/93)。二者至少有一种基因被检出的检出率为91.39%(85/93)。结论福氏2a志贺菌的快速诊断可应用ShET1、ShET2双基因PCR检测,具有较高的敏感性与特异性。在应用多生物学标志进行福氏2a志贺菌同源克隆鉴定系统研究时,肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析是不可或缺的分析指标。

福氏2a志贺氏菌2457T HtpG蛋白诱导小鼠炎性反应

【目的】构建福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株和回复株,对HtpG蛋白的功能进行初步研究。【方法】采用λ-Red重组系统对htpG基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株,并利用低拷贝质粒构建了htpG突变株的回复株。在此基础上,对野生株、突变株和回复株的生长曲线、生化反应、豚鼠角膜试验进行了比较分析,并考察了野生株、突变株和回复株腹腔注射引起小鼠炎症反应的强弱。【结果】HtpG蛋白功能与福氏志贺氏菌的基本生化代谢无关,也不影响细菌穿透上皮细胞的能力,但腹腔注射后能够引起小鼠强烈的炎症反应。【结论】HtpG蛋白功能可能与细菌的免疫致病性相关。

不同地区福氏2a志贺菌质粒DNA多态性分析

目的 对福氏 2a志贺菌质粒DNA进行基因分型 ,提高福氏 2a志贺菌痢疾暴发流行时同源克隆的鉴定分析水平。方法 对 93株分离自不同地区、不同时间的福氏 2a志贺菌用质粒图谱和限制性内切酶图谱法进行基因分型和同源克隆鉴定。结果 质粒DNA分析表明 ,不同地区、不同时间分离的 93株福氏 2a志贺菌具有 1 3种不同的质粒DNA图谱特征 (PLT1～PLT1 3型 )和 1 5种限制性内切酶图谱特征 (ReT1～ReT1 5型 )。结论 93株来自不同地区、分离自不同时间的福氏 2a志贺菌分属于 1 5个克隆群 ,PLT型和ReT型分布呈现多态性特征 ,PLT1 /ReT1型是海南、江门、蚌埠、合肥、安庆地区福氏 2a志贺菌的优势克隆群组。表型相同的福氏 2a志贺菌实际上是遗传结构多态性群体的集合 。

福氏志贺氏菌2a单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立

为制备特异性和灵敏度较高的抗福氏志贺氏菌2a单克隆抗体,并建立双抗夹心酶联免疫吸附检测法,用于检测生鲜食品中的福氏志贺氏菌2a。本研究利用自制的福氏志贺氏菌2a抗原免疫BALB/c小鼠,并用杂交瘤技术进行细胞融合,经筛选克隆后,获得3株分泌抗福氏志贺氏菌2a单克隆抗体稳定的杂交瘤细胞,分别命名为5C12、1B5和6A11。3株杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后,诱导产生的腹水中抗体的效价为1∶2.048×10~5~1∶1.024×10~5,免疫球蛋白亚型均为IgG。3株抗体识别抗原表位的最佳配对为5C12和6A11,由此建立双抗夹心ELISA体系,测得其灵敏度为1 000 CFU/g,且具有良好的特异性。

芳香族依赖性福氏志贺氏2a型活菌苗候选株的组建:aroA和aroD基因的缺失突变

细菌性痢疾遍布世界各地。估计每年世界上菌痢的发病率在1亿人次以上且有近60万人死亡。由痢疾志贺氏菌I型和福氏志贺氏菌引起的菌痢特别严重且常引起慢性感染。痢疾菌的感染剂量很小。在成年志愿者研究中发现,福氏志贺氏2a型菌的ID_(10)约为10个细菌,ID_(50)<1000个细菌。

福氏2c(新菌型)和福氏2a志贺菌生物学关系实验研究

目的:研究福氏志贺菌2c与2a之间的生物学关系。了解新菌型的生物学特性。方法:对前述2株菌进行生化试验、噬菌体裂解试验、药物敏感试验和血清凝集试验。结果: 2株菌的生化反应、噬菌体裂解模式均相同。福氏志贺菌2c同时含有群抗原3, 4和7,对乙基西羧霉素、庆大霉素、卡那霉素耐药,而福氏志贺菌2a则对以上3种药物敏感。结论:新发现的福氏志贺菌2c与福氏志贺菌2a在药物敏感性上存在较大的差异。

弗氏2a志贺菌2457T株碱性蛋白质组图谱的建立

目的:建立弗氏2a志贺菌2457T株的碱性蛋白质组图谱。方法:首先采用双向电泳技术对弗氏2a志贺菌2457T株表达的全部碱性菌体蛋白及碱性膜蛋白进行分离,再通过基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱进行鉴定。结果:共鉴定到46个蛋白点,对应于38种蛋白质。结论:首次完成了弗氏2a志贺菌2457T株的碱性蛋白质组图谱。

福氏2a志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因分型在菌痢暴发研究中的应用

目的 对福氏 2a志贺菌肠毒素ShET1(Shigellaenterotoxinl)和肠毒素ShET2 (Shigellaenterotoxin2 )进行基因分型 ,提高菌痢暴发流行时同源克隆的鉴定分析水平。方法 对在菌痢暴发期间分离的 8株福氏 2a志贺菌用PCR法检测志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因 ,进行基因分型和同源克隆鉴定。结果 8株福氏 2a志贺菌可分为 3种基因型 ,即 2株ShET1(- ) /ShET2 (+) ,1株ShET1(+) /ShET2 (- ) ,5株ShET1(+) /ShET2 (+)。结论 本次菌痢暴发部分患者可能并非真正的暴发病例 ,之所以被归入暴发事件之中 ,可能是一种与暴发事件在空间。

痢疾杆菌福氏2a及其环丙沙星耐药株gyrA和parC基因耐药性决定区的序列分析

测定了痢疾杆菌福氏 2a 30 1株与喹喏酮类药物耐药性相关的 gyrA基因和 parC基因的序列 ,并对其环丙沙星耐药诱变株的 gyrA和 parC基因喹喏酮类药物耐药性决定区 (QRDR)序列进行了测定分析。结果表明 ,痢疾杆菌福氏 2a 30 1株 gyrA和 parC基因分别为 2 6 2 5bp和2 2 5 6bp ,环丙沙星诱导的耐药菌 gyrA基因QRDR(2 4 5bp)发生氨基酸残基 6 9 Ala→Val和 87 Tyr→Asp改变 ,parC基因QRDR(2 37b)发生氨基酸残基 79 Ala→Asp、84 Ala→Glu和 85 Pro→Ala改变。

温度、pH值、盐度交互作用优化福氏志贺氏菌F2b培养条件

研究温度、pH值、盐度3个因素交互作用下食源性致病微生物福氏志贺氏菌F2b的最优培养条件。在温度、pH值、盐度单因素试验的基础上,应用Box-Behnken中心组合试验原理,设计三因素交互作用试验。以温度、pH值、盐度为响应因子,以菌液的OD550为响应值,采用响应面法处理试验数据。结果表明,在所选的因素水平范围内,温度、pH值对F2b生长影响显著,温度、pH值之间交互作用显著。获得志贺氏菌F2b的最佳生长条件为温度35.8℃,pH值7.7,盐度0.76g/dL。经过验证,实测值和预测值之间偏差为1.1%,表明响应面法优化F2b培养条件真实、快速、有效。

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的:原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法:用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用WesternBlot检测融合蛋白的表达。结果:构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;WesternBlot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论:在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。

福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的克隆及其原核表达

根据福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点的序列,以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板扩增了marA基因序列。将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α。鉴定成功获得目的片段后,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切并与载体pET-30a连接,构建原核表达质粒pET-30a-marA,并将其转化宿主菌BL21(DE3)pLys,用IPTG诱导其表达。SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-30a-marA可成功地在大肠杆菌中表达MarA蛋白。Western-blotting检测证明,该蛋白能与志贺菌阳性血清发生特异性反应。

福氏2a志贺菌痢暴发的RAPD分析

目的 探讨江门一起菌痢暴发的特异传染源。方法 对 8株福氏 2a志贺菌进行RAPD分析。结果 此次菌痢暴发期间分离的 8株福氏 2a志贺菌具有两种不同的RAPD特征 (RTⅠ、RTⅡ型 ) ,其中 2株病例密切接触者分离株J9810 1(RTⅡ型 )和J982 6(RTⅠ型 )分属不同克隆。结论 本次暴发偶合有部分散发病例。相对于质粒分析而言 ,RAPD分析具有更高的分辨率 ,它提供的遗传学信息更为丰富、直接。

福氏2a志贺菌DNA转录激活蛋白MarA的二级结构及其B细胞抗原表位预测

研究以福氏2a志贺菌(Shigella flexneri2a,s.f2a)的基因组序列为材料,采用Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Kamplus-Schulz法预测了其DNA结合转录激活蛋白MarA的二级结构,用Kyte-Doolittle法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini法预测了蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf法预测了蛋白的抗原指数,然后综合评价了福氏2a志贺菌转录激活蛋白MarA的B细胞抗原表位。结果表明:福氏2a志贺菌MarA蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋和β-折叠区段,该蛋白有多处抗原指数较高的区段,其中含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视。