大鼠胰腺离体灌注技术的建立

目的建立大鼠离体胰腺灌注技术。方法采用大鼠离体胰腺灌注技术对10只高脂肥胖大鼠胰岛β细胞功能进行研究。结果6只大鼠符合胰腺整体灌注胰腺完整性的评定标准:(1)在整个灌注期间灌注压保持在(70±5)mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。(2)灌注结束后检测分离的胰腺十二指肠组织块,均存在十二指肠蠕动活性。(3)持续精氨酸刺激较持续高糖刺激胰岛素分泌幅度明显增高[最大胰岛素分泌率:(987±100)μU/min vs(545±50)μU/min,P<0.05;平均胰岛素分泌率:(544±73)μU/min vs (260±28)μU/min,P<0.05]。结论成功建立了大鼠胰腺整体灌注技术,此技术可用于大鼠离体胰岛β细胞功能研究。

Ghrelin对大鼠离体胰腺胰岛素分泌及Glut-2蛋白表达的影响

目的探讨Ghrelin对大鼠离体胰腺组织胰岛素分泌及葡萄糖转运蛋白-2(Glut-2)表达的影响。方法将25只Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、高糖组(HCG组)、高糖+高浓度Ghrelin(10-8mol/L)组(HCG+HCGh组)、高糖+中浓度Ghrelin(10-9mol/L)组(HCG+MCGh组)及高糖+低浓度Ghrelin(10-10mol/L)组(HCG+LCGh组),每组5只。建立大鼠离体胰腺灌注模型,经腹主动脉远端相应灌注低糖(5.5 mmol/L)、单纯高糖(33.3 mmol/L)溶液或加入上述不同浓度Ghrelin的高糖(33.3 mmol/L)溶液。采用ELISA法测定门静脉流出液的胰岛素水平,采用免疫组化染色方法半定量测定Glut-2蛋白在离体胰腺组织中的表达水平,采用透射电镜观察胰岛β细胞的超微结构改变。结果 5组大鼠的空腹血浆葡萄糖(FBG)、空腹血浆胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素分泌指数(HOMA-β)比较差异均无统计学意义(P>0.05)。用低糖溶液灌注时,5组大鼠门静脉流出液的胰岛素水平比较差异无统计学意义(P>0.05);而用高糖溶液灌注后,胰岛素的分泌在3 min和10～12 min时出现了2个高峰(以HCG+HCGh组最高)。NC组大鼠胰岛β细胞Glut-2蛋白的平均光密度值高于其余4组(P<0.05)。透射电镜观察结果显示,高糖各组大鼠离体胰腺的凋亡征象较NC组严重,但HCG+HCGh组的细胞器损害程度较HCG+MCGh组及HCG+LCGh组轻。结论在大鼠离体胰腺中,Ghrelin可促进高浓度葡萄糖诱导的胰岛素分泌,对胰岛β细胞起保护作用。

肾被膜下胰岛移植治疗1型糖尿病模型小鼠的研究

目的观察经肾被膜下小鼠胰岛移植模型改良方法的移植效果。方法采用胆总管内逆行灌注联合胰腺离体多点灌注法消化胰腺,镜下手工挑选胰岛细胞,分别用台盼蓝染色检测活性,双硫腙(DTZ)染色检测纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测分离提取胰岛的功能。链脲佐菌素170 mg/kg腹腔内注射,建立1型糖尿病小鼠模型;空白对照组(n=13),实验组(n=13)为1型糖尿病模型小鼠并给予同种异体胰岛细胞肾被膜下移植,移植术后监测随机血糖,移植后第10天行葡萄糖耐量检测,移植后第29天切除实验组左肾行HE染色观察移植物情况。结果每只小鼠可以获得(200.23±30.18)个胰岛细胞团,且纯度和活性都>90%;高糖组每个胰岛素释放量为(1.98±0.20)ng/胰岛,低糖组检测每个胰岛素释放量为(0.69±0.11)ng/胰岛,高糖组为低糖组的2.87倍(P<0.05);移植术后实验组血糖第1、2天逐步下降,并在第3天全部降至正常,移植术后第4、6、7、14、21、28天两组血糖水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);实验组摘除左肾术后血糖比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组糖耐量比较,差异无统计学意义(P>0.05);实验组切除左肾后血糖持续升高,HE染色切片显示肾被膜下胰岛移植物表面和内部已有新生血管生成存活良好。结论采用改进后分离和移植胰岛方法可以保证获得高质量的胰岛细胞,提高胰岛产量及移植模型的成功率,是一种高效稳定的技术方法,为下一步实验药物干预筛选奠定了基础。