常压室温等离子体诱变(ARTP)及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探

为提高酱油发酵菌种米曲霉的蛋白酶活力,采用实验室保藏菌种H0米曲霉为诱变出发菌株,对H0菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),诱变条件:功率120 W;气流量10L/min;10个时间梯度处理。结果表明:当诱变时间为140s时,致死率接近90%,此时为最佳诱变时间。利用大豆球蛋白作为选择培养基关键因子进行初筛和96孔板高通量复筛,选出3株高蛋白酶活力菌株H5,H12,H15,并且经过福林酚法验证。最终筛选出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力:酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别为192.35,1816.31,3774.82U/g,比出发菌株H0分别提高17.49%,19.08%,10.66%。

常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株

采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株,选育对亚洲玉米螟高毒力突变株。经过4轮的ARTP诱变、镜检及摇瓶发酵筛选得到的突变株Bt-NBIC-380-18-407,其摇瓶发酵液对玉米螟二龄幼虫效价达到6 835 IU/μL,杀虫晶体蛋白含量6.3 mg/mL。该突变株的效价较初始菌株提高了25.7%,杀虫晶体蛋白含量提高了18.9%。经过5次传代,证实该突变株具有良好的遗传稳定性。

常温常压离子体诱变红缨子高粱及初步筛选

酒用高粱产业是贵州省遵义市特色支柱产业,红缨子作为遵义市当地最典型的小糯高粱品种,受到酿酒企业及种植户的重视,迫切需要选育符合山地机械化生产的酱香型酒用糯高粱品种。采用常温常压离子体技术对红缨子种子进行辐射损伤诱发突变,并对M1(诱变一代)自交产生的M2植株进行农艺性状测定,采用单因素方差分析法,初步筛选出两个株高较低与淀粉质量分数较高的高粱品种。

庚基灵菌红素高产菌株Notoacmeibacter sp.BGMRC2072的常压室温等离子体诱变(ARTP)选育

为了获得稳定高产庚基灵菌红素(Heptylprodigiosin,HPG)的优势突变菌株,利用常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变处理海洋细菌Notoacmeibacter sp.BGMRC2072,结合单菌落的颜色、形态及菌体生物量OD600进行初筛,再依据突变菌株的庚基灵菌红素产量、生物量及比生长速度,筛选出最佳突变菌株,并对其进行遗传稳定性测试。最终筛选得到一株高产庚基灵菌红素的突变菌株B13,其庚基灵菌红素产量为748.91-756.27 μg/mL,比出发菌株(384.27 μg/mL)增加94.9%,且突变菌株B13具有良好的遗传稳定性。本研究表明ARTP诱变可明显提高海洋细菌Notoacmeibacter sp.BGMRC2072的庚基灵菌红素产量,且突变菌株的遗传稳定性较好。

常压室温等离子体(ARTP)诱变及工艺优化筛选螺旋霉素高产菌株

以一株纯化稳定螺旋霉素生产菌株(SPM16-92)为出发菌株,采用新型常压室温等离子体ARTP进行诱变选育,经过大量诱变选育工作,筛选出四株突变菌株,相比出发菌株,突变株SPM16-303效价提高了21.7%,且性状相对稳定;以生产稳定菌株SPM16-92为实验菌株,在发酵瓶培养前期分别添加不同的前体,结果表明,在发酵开始20h左右时,添加0.5%的正丙醇发酵效价能提高10.3%;以突变菌株SPM16-303为出发菌株,验证添加前体工艺,在突变提高基础上还能提高6.7%,突变菌株以添加前体工艺验证,相比原工艺生产菌株效价提高了28.4%。

布洛芬立体拆分菌株的筛选与离子束诱变选育

在从土壤中分离到的 15 4个菌株中 ,通过筛选及旋光度的测定得到立体选择性水解布洛芬乙酯生成S 布洛芬的菌株CandidasorboxylosaT2P。用低能离子束诱变的方法得到了几株布洛芬乙酯水解活性提高的突变菌株 ,用 4× 10 5ion/cm2 剂量的低能离子束诱变菌株CandidasorboxylosaT2P可提高S 布洛芬的产量2 0 %左右。用菌株CandidasorboxylosaT2P的培养物催化水解布洛芬乙酯所得产品的外观、熔点、旋光度和红外光谱等各项检测指标与Sigma公司的标准品S 布洛芬基本一致 ,这表明该菌株具有提高S

常压室温等离子体诱变选育高产TTMP菌株

从新疆伊犁肖尔布拉克酒厂生产的酱香型高温大曲中筛选得1株能代谢四甲基吡嗪(TTMP)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)R19,以该菌株为出发菌株,采用常压室温等离子体诱变系统(ARTP)进行诱变,根据脱脂奶粉平板初筛、摇瓶发酵复筛,连续传代培养后得到遗传稳定的TTMP产量较高的突变株T451,该菌株摇瓶发酵生产TTMP的产量为1.19 g/L,约为出发菌株产量的4.45倍。

常压室温等离子体诱变高通量筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变株

采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6,并应用显色法和96孔板培养方法筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变株。研究表明显色反应时添加四硼酸钾溶液1μL、PDABA 125μL、反应时间5 min、反应温度96℃时,N-乙酰氨基葡萄糖检测的准确度最高。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得突变株(4A12),3 L罐发酵Glc NAc产量达到36.14 g/L,较出发菌株(BSGN6)提高了65.32%。经过50次传代后性状稳定。ARTP诱变技术作为获得产N-乙酰氨基葡萄糖高产菌株的有效途径,与分子生物学手段相比,本方法更加快捷高效。

农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变

旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂以及杀菌剂共存的复杂环境的适应性,以生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum,GIM 3.442)为出发菌株,采用常压室温等离子体的方法对出发菌株进行诱变。结果显示,以杀菌剂代森锰锌和杀虫剂呋虫胺为筛子,选育出对复合农药有良好抗性的诱变菌株。从中挑选双抗性最好的菌株Th-36,以含有杀菌剂代森锰锌、杀虫剂呋虫胺和除草剂乙氧氟草醚的PDA为诱变筛选培养基,再次进行诱变筛选,获得两株具有三抗特性菌株(Th-3-36和Th-4-B)。毒力测试表明,抗性菌株Th-3-36和Th-4-B对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的EC50分别达到5 089.2μg a.i.·m L-1和5 498.2μg a.i.·m L-1、758.5μg a.i.·m L-1和785.9μg a.i.·m L-1、198.2μg a.i.·m L-1和200.3μg a.i.·m L-1,均高于各农药的市售平均推荐使用浓度。筛选到的突变株对农药抗性明显增强、遗传了亲本的广谱抗菌性并具有良好的遗传稳定性,生长繁殖能力和酶学性质优于亲本菌株。

紫外-ARTP复合诱变选育达巴万星前体高产菌株

采用紫外-常压室温等离子体(ARTP)技术对达巴万星前体产生菌野野村放线菌属(Nonomuriaspp.)菌株DW-3-19进行复合诱变,并进行链霉素抗性突变选育,获得了具有稳定遗传性的高产菌株,该菌株发酵单位比出发菌株提高了68.7%。表明,ARTP技术可有效应用于放线菌的诱变选育,紫外-ARTP复合诱变可提高达巴万星前体发酵单位,降低生产成本,为短时间内获得稳定遗传的高产菌株提供了可行的方法。

蛹虫草高产菌丝体蛋白菌株的ARTP 诱变选育

目的:筛选高产蛋白蛹虫草菌株,降低食用菌蛋白(蛹虫草蛋白)的生产成本。方法:优化蛹虫草原生质体制备、再生等条件,并采用ARTP诱变系统诱变原生质体,确定最佳的诱变条件。结果:最佳的诱变条件为0.6 mol/LNaCl溶液作为原生质体的渗透压稳定剂,ARTP处理240 s,菌株致死率达到93%。诱变、筛选得到高产蛋白突变菌株,菌丝体蛋白产量比出发菌株提高了20%以上,连续6次转接遗传性状稳定。200 L罐工业化发酵试验,菌丝体蛋白产量达到6.5 g/L。选育的菌株具有非常好的工业化生产应用潜力。

利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株

为筛选β-胡萝卜素产量差异菌株,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,简称ARTP)诱变三孢布拉氏霉菌孢子,研究不同处理时间对三孢布拉氏霉菌存活率的影响,建立有效的筛选方案,经由洛伐他汀筛选,菌丝产生不同的颜色差异,初步获得β-胡萝卜素产量差异菌株。结果表明,随着ARTP诱变处理时间的增加,其致死率逐渐增高,较为理想的处理时间为160~200 s;洛伐他汀扩大了突变体之间的颜色差异,促进了正突变株的产生;传代并纯化突变体,获得洛伐他汀筛选菌株10株,其中深黄4株、黄色3株、浅黄2株、白色1株,正突变菌株β-胡萝卜素产量上升48.6%,负突变株产量下降16.5%。

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法对绿色产色链霉菌AVL4(S.viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S.viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为:以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/m L的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/m L,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。

常压室温等离子体诱变选育淀粉酶菌株及其酶学特性研究

目的:以云南马龙C3F-2016烟叶表面筛选的产淀粉酶菌株为出发菌株,诱变选育高产淀粉酶菌株并研究诱变前后酶学特性。方法:ARTP技术选育菌株后采用3,5-二硝基水杨酸法测定诱变前后菌株产生的淀粉酶酶活力,并探讨不同温度、不同pH、金属离子、紫外光对淀粉酶活力的影响。结果:诱变选育出一株酶活力有较大提高且传代稳定的突变株Bacillus koreensis FS-103,其淀粉酶活力达9050 U/mL,较出发菌株提高了90%。高产突变株FS-103所产淀粉酶的最适作用温度为60℃,最适作用pH5.5,在40~50℃和pH5~6之间具有良好的稳定性,Ca^(2+)、Mg^(2+)对淀粉酶活性具有促进作用,紫外照射对淀粉酶活力影响减弱。结论:此诱变选育产淀粉酶菌株的方法可行,为该类菌株进行酶制剂的研究与开发奠定理论基础。

用离子束介导外源全DNA转化拟南芥菜的诱变体

植物特别是高等植物在漫长的历史形成过程中所具有的遗传保守性一般很不易打破，但用生物技术方法，目前可以打破，且可创造新的突变体和新物种，由此可达此目的。例如郑州大学离子束生物工程实验室的卞坡博士和华中农业大学食品科技学院的谈重芳先生等利用离子束介导外源全DNA转化拟南芥菜的诱变效应就是例证之一。

原生质体诱变在工业微生物育种中的应用进展

介绍了原生质体诱变技术,综述了其在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素、杀虫剂等高产菌种选育中的应用进展;对该技术与离子束技术、空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了展望。

氮离子束对离体和体内DNA影响的初步研究

本文研究了N^+离子束对体内(JM109)和体外质粒PBR322DNA的辐照效应,经琼脂糖电泳检测发现:在体外直接辐照,引起超螺旋环状DNA的单链断裂而转变成开环状DNA:而体内质粒PBR322DNA由于质膜和细胞壁的保护,或命中概率降低,尚存在微弱的超螺旋DNA带,此说明,N^+离子束作用环状DNA能引起DNA链的断裂,这具有生物学的意义。

低能离子射线诱变桑黄菌株SH009的初步研究

采用低能离子射线诱变原生质体选育桑黄菌株SH009,在确定诱变剂量效应曲线的基础上选择了1.5×1015ions/cm2氮离子的诱变处理剂量。经过对诱变原生质体单个再生菌落的筛选,得到8株变异株,选取生长速度较快的5个菌株进行摇瓶培养,这5个菌株的菌丝体多糖和总黄酮产量均比出发菌株有所提高,其中P4的多糖和总黄酮产量分别比出发菌株提高了87.76%和73.24%。5个诱变菌株经平板传代5代以后的生长速度均保持稳定,无明显回复突变。结果表明,采用低能离子射线诱变桑黄菌株是一种有效的诱变育种方法。

离子束介导外源全DNA转化拟南芥菜的诱变效应

用 30kev的Ar+ 离子 ,以 1.5× 10 17ions/cm2 的注入剂量分别介导外源拟南芥菜 (Lansberg生态型 )、甘蓝、红甜菜和芦荟的全DNA转化拟南芥菜种子 (Columbia生态型 )。转化当代营养期表型变异率与外源供体和转化受体的亲缘远近没有必然的联系 ,而低育性株率却随着外源供体亲缘关系的从近到远 ,呈现一种从低到高再变低的变化趋势。从低育性株后代中选育出 2个稳定的突变体 ,该突变体不但保持了其亲本的低育性 ,而且其他性状也有较显著的变异 ,如株型、叶型等。

湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素藻株培养条件的优化

为进一步提高湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)的工业利用价值,本研究使用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变仪对湖泊红球藻进行等离子诱变。以藻细胞致死率为指标确定等离子诱变的适宜输入功率和诱变时间。诱变之后通过固体平板培养初筛和液体培养复筛获得高产虾青素的突变藻株。再以藻细胞密度为指标采用单因素实验及正交试验对高产藻株的营养生长阶段的培养条件进行优化,并筛选虾青素诱导阶段适宜虾青素积累的高光照条件。在优化的培养条件下多次继代后观察高产突变藻株的遗传稳定性。结果表明,湖泊红球藻等离子诱变的适宜条件是功率240 W、诱变时间150 s或功率400 W、诱变时间120 s。通过初筛和复筛获得生长快、虾青素产量高的突变藻株有11株,其中编号为HP3的突变藻株生长最快、虾青素产量最高,培养后藻细胞密度和虾青素产量较出发株分别提高了25.5%和61.6%。经过两阶段培养条件的优化,HP3的藻细胞密度和虾青素产量较优化前分别提高了14.3%和19.3%,达7.2×10^(5)cell/mL和31.264 mg/L。湖泊红球藻高产突变藻株HP3多次继代后藻细胞生长良好,遗传稳定,培养后藻细胞密度和虾青素产量均与初代培养相近。研究结果对湖泊红球藻产虾青素工业藻株的选育具有实际意义。