人肾高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白基因的克隆和生物信息学分析

为探讨人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白 (humanhigh affinitysodium dependentdicar boxylatetransporter,hSDCT2orhNaDC3 )基因在人体内的生理功能及其与疾病的关系 ,借助生物信息学成功地从人肾中克隆了hSDCT2基因 (GenBank接收号 :AY0 72 810 ) .首先将大鼠SDCT2cDNA与人EST数据库进行同源性比较 ,获得具有高度同源性EST片段并用DNAstar软件将它们拼接成EST重叠群 .在重叠群上设计PCR引物从人肾总RNA中用RT PCR扩增出hSDCT2基因并测序 ,然后用软件对其结构特性、组织分布及基因定位进行分析 .序列测定结果显示 ,hSDCT2开放阅读框为180 9bp ,共编码 6 0 2个氨基酸 .蛋白同源性分析表明 ,其氨基酸序列与大鼠及小鼠SDCT2分别有85 %和 87%相同 .二级结构分析显示 ,该蛋白有 12个跨膜螺旋区 .Northern分析显示 ,该基因可在肾、肝、脑、胎盘等多种组织中表达 ,并定位于 2 0号染色体的q12～q13

慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血白细胞中钠离子依赖性维生素C转运体的表达

用免疫组化和Western blot技术检测SVCT1和SVCT2蛋白在慢性乙型肝炎患者及正常人外周血白细胞中的表达.免疫组化结果显示:在慢性乙型肝炎患者肝组织中SVCT1和SVCT2蛋白的阳性表达率和阳性表达强度显著低于正常肝组织(P<0.01);Western-blot检测显示,慢性乙型肝炎患者外周血白细胞中SVCT1表达缺失,SVCT2蛋白表达强度为0.481±0.056,均显著低于正常人(分别为0.325±0.085和0.971±0.140)(P<0.01).提示慢性乙型肝炎患者体内肝细胞和外周血白细胞存在SVCT1和SVCT2蛋白表达低下或缺失;SVCT1和SVCT2蛋白表达低下或缺失可能是乙型肝炎病毒易感性的主要原因之一.

β-螺旋桨植酸酶的金属离子依赖性

β-螺旋桨植酸酶主要来源于芽孢杆菌,是能够分解植酸释放磷元素,并且与金属离子有关的一类酶。β-螺旋桨植酸酶具有独有的Ca2+依赖性和对植酸-Ca2+复合物的底物专一性。本文综述以Ca2+为主的金属离子与β-螺旋桨植酸酶的关系。

活化钙离子依赖性蛋白酶诱导血小板凋亡的研究

目的:探讨钙离子依赖性蛋白酶(calpain)在血小板凋亡中的作用。方法:Calpain活化剂dibucaine处理血小板后,采用流式细胞仪检测血小板线粒体跨膜电位(ΔΨm)去极化,磷脂酰丝氨酸(PS)外翻;western blot检测caspase-3活化以及calpain底物talin酶切。结果:Dibucaine能诱导血小板ΔΨm去极化,PS外翻,caspase-3活化,以及calpain底物talin的酶切;calpain抑制剂能完全抑制dibucaine诱导的ΔΨm去极化、PS外翻、caspase-3活化,以及talin的酶切。结论:Calpain在血小板凋亡中发挥重要作用,活化calpain能诱导血小板凋亡。

野葛钙离子依赖性核酸酶PlCaN基因克隆和生物信息学分析

拟克隆野葛钙离子依赖性核酸酶PlCaN基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,同时构建其原核表达载体。提取野葛材料总RNA作为模板,利用逆转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增技术(rapidamplification of cDNA ends,简称RACE)等方法获取野葛PlCaN的cDNA全长序列,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,构建原核表达载体p BRT7-PlCaN并鉴定。结果表明,PlCaN的cDNA全长1 008 bp,编码335个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为37.3 ku,理论等电点(pI)为9.4,为亲水性蛋白,无信号肽,表明原核表达载体p BRT7-PlCaN构建成功,为探究其在不同组织中的表达情况,建立原核表达体系,并为后期PlCaN的功能研究提供理论基础。

锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合

目的观察卡介苗（BCG）的锌离子依赖金属蛋白酶1（Zmp1）对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法在大肠杆菌BL21（DE3）中克隆表达Zmp1,用金属螯合磁珠纯化;用纯化的Zmp1处理RAW264.7细胞,采用CCK-8法检测（0、24、48、72、96）h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期分布;用减毒沙门菌感染RAW264.7细胞诱导吞噬体形成后,用Zmp1处理细胞,在吞噬体内的减毒沙门菌和溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）分别用相应Alexa Fluor（R）350抗沙门菌抗体（蓝色荧光）和Cy5抗LAMP1抗体（红色荧光）标记,通过荧光显微镜观察RAW264.7细胞内两种荧光,将其重合分析吞噬体与溶酶体融合情况。结果用Zmp1蛋白处理细胞48 h后,细胞增殖活性明显降低;处理48 h后,细胞周期中G1期细胞比例下降,S期比例增高;采用双荧光标记感染沙门菌的RAW264.7细胞,Zmp1处理后显示紫色荧光的吞噬溶酶体融合减少。结论 Zmp1抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制吞噬体-溶酶体融合。

乳腺肿瘤细胞周期蛋白E被钙离子依赖性蛋白酶剪切成低分子量片断

乳腺肿瘤富含高活性的低分子量细胞周期蛋白E,并导致细胞周期蛋白依赖性激酶2功能失调,但其低分子量片断的形成机制尚不清楚。对乳腺肿瘤低分子量细胞周期蛋白E通过翻译后水平的某种蛋白酶作用形成的这一假说进行了探讨。钙离子可诱发乳腺肿瘤培养细胞ZR75周期蛋白E剪切为分子量与乳腺肿瘤组织相似的小分子片断。纯化Calpeptin能抑制上述过程,提示剪切过程与钙离子依赖性蛋白酶(Calpain)活性有关。同样,钙离子+纯化Calpain也能引起乳腺肿瘤细胞和组织免疫沉淀周期蛋白E的剪切。钙离子还能引起肿瘤细胞和组织Calpain调节(小)亚基有限水解,表明Cal-

钠离子依赖性中性氨基酸转运载体2特性、表达调控及功能

转运系统A载体——钠离子依赖性的中性氨基酸转运载体2(SNAT2)是近年发现的氨基酸转运感受体的典型代表,是体内主要的氮转运载体。SNAT2通过转运过程调节细胞内氨基酸浓度,进而调控细胞内氨基酸感受体的下游信号,发挥氨基酸转运载体和信号受体的双重功能,而成为近年氨基酸营养感应的研究热点。本文围绕SNAT2的分子特性、生物学特性、表达调控及其介导的氨基酸感应信号的研究进展进行综述。

钙离子依赖型凝集素样受体2(CLEC-2)研究进展

钙离子依赖型凝集素样受体2(calcium-dependent lectin-like receptor 2,CLEC-2)是近年发现的血小板表面受体,相对分子质量(Mr)约32 000,是一种Ⅱ型跨膜受体。蛇毒蛋白Rhodocytin和唾液酸样糖蛋白Podoplanin是目前被分别鉴定出的CLEC-2的外源性和内源性配体。配体与受体相互作用后,通过Src及Syk依赖的酪氨酸激酶途径活化下游分子,最终激活PLCγ2,产生第二信使的生理效应,引起血小板活化聚集。研究表明CLEC-2与配体的相互作用和血栓性疾病、肿瘤转移和进展以及血小板捕获HIV-1并呈递给靶细胞等过程密切相关。因此,阻断两者相互作用可能成为治疗上述疾病的新靶点。

锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理

目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1(Zinc metalloprotease-1,Zmp1)对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法:6~8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为p Bud CE4.1空质粒对照组(n=7)、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE68p质粒组(n=9)、表达PPE68抗原的p Bud CE4.1-PPE68质粒组(n=9)、PPE68抗原和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68-Zmp1质粒组(n=10)及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组(n=8)。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道s Ig A的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果:与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ(117.29±16.86,P=0.034)、IL-12(40.46±7.11,P=0.0037)、淋巴细胞刺激指数SI(3.30±0.49,P=0.004)均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ(132.75±28.40,P=0.070)、IL-12(55.43±11.78,P=0.198)、SI(4.70±1.57,P=0.124)。结论:卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。

顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体在小肠癌组织中的表达及其意义

目的:研究顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体(ASBT)在小肠癌组织中的表达,探讨其在小肠癌发生中可能的意义。方法:采用免疫组织化学显色和蛋白印迹检测ASBT在人小肠腺癌、黏液腺癌、小细胞癌及其癌旁正常组织中的表达。结果:ASBT在癌旁正常小肠组织主要表达于小肠吸收细胞游离面的胞膜;在小肠癌中,ASBT表达明显下调,在小肠黏液腺癌和小细胞癌还可见ASBT的细胞核异位表达。结论:ASBT在小肠癌组织中表达下调和异位表达提示编码ASBT的基因第10溶质转运蛋白家族第2成员(SLC10A2)可能作为一种新的抑癌基因在小肠癌的发生过程中起重要作用。

培养的主动脉平滑肌细胞的钙离子依赖性钾通道开放状态检测及其门控模型的初步研究

对培养的主动脉平滑肌细胞的钙离子依赖性钾通道 (Ca2 + -dependent k+ channels in cultural aortic smooth musclescells)单通道记录进行了分析 ,检测其开放 (关闭 )状态个数 ,并提出相应的备择马尔科夫门控动力学模式 。

以金属离子依赖性蛋白为靶标的抗病毒药物研究进展(2021-2023)

金属离子依赖性蛋白在病毒复制、组装和宿主细胞侵袭等关键环节中发挥着核心作用,使其成为抗病毒治疗策略的理想靶点。从药物化学的角度出发,综述了2021—2023年,以金属离子依赖性蛋白为靶标的抗病毒药物研究的新进展。详细分析了人类免疫缺陷病毒、人类巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、裂谷热病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒等重要病毒的金属离子依赖性蛋白抑制剂,探讨了这些抑制剂的药理活性、作用机制及临床应用潜力。同时强调了设计病毒金属酶抑制剂面临的挑战,如确保高度选择性和特异性、药物稳定性、生物利用度等,以及应对病毒高变异率导致的耐药性问题。最后总结了抗病毒药物研发的新趋势,包括结构基础药物设计、高通量筛选、片段生长和多位点结合策略等,为开发新型高效低毒抗病毒药物提供了新的思路和方法。

电压依赖性阴离子通道与糖尿病肾脏疾病研究进展

电压依赖性阴离子通道(voltage dependent-anion channel,VDAC)位于线粒体外膜,是一种转运三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和细胞间代谢产物的通道蛋白,对线粒体代谢及细胞生长起着重要的调节作用。最近的研究表明,VDAC在心肌病、动脉粥样硬化、高血压和糖尿病(diabetes mellitus,DM)中均有显著升高。糖尿病肾脏疾病(diabetes kidney disease,DKD)是糖尿病的主要微血管并发症,是导致终末期肾病的最常见原因,其发病机制复杂,VDAC参与其中。本文对VDAC蛋白的结构、特性、作用机制以及与DKD关系的研究进展进行综述。

液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法测定烟用香精香料中9种有机酸的含量

采用液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法定性定量检测烟用香精香料中苹果酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、己二酸、乙酰丙酸等9种有机酸。取0.1 g烟用香精香料样品,加入20 mL水,超声提取10 min。取上清液1 mL,过0.22μm水相滤膜后用水稀释10倍,按照优化的仪器工作条件测定。在Synergi Hydro-RP色谱柱上用不同体积比的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液的混合液梯度洗脱分离各有机酸后,用电喷雾离子源负离子模式电离,多反应监测-信息依赖采集-增强子离子(MRM-IDA-EPI)模式扫描,MRM模式定量,保留时间结合EPI标准品二级质谱库定性。结果表明:9种有机酸的质量浓度均在一定范围内和定量子离子峰面积呈线性关系,检出限(3s/k)为0.003~0.018 mg·L^(-1);对实际样品进行加标回收试验,回收率为73.3%~112%,日内(n=6)、日间(n=5)精密度试验所得测定值的相对标准偏差分别不大于10%和不大于15%;方法用于142种烟用香精香料样品的分析,检出率较高的4种有机酸为乳酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸。

中电导性钙离子依赖性钾通道在肝细胞再生蛋白-3促进结肠癌上皮间质化中的作用机制

目的 探讨中电导性钙离子依赖性钾通道（KCNN4）通道在肝细胞再生蛋白-3（PRL-3）诱导结肠癌细胞Lovo上皮间质化（EMT）中的作用机制.方法 用KCNN4通道蛋白特异性阻滞剂TRAM-34和KCNN4-小干扰RNA（siRNA）分别处理已经稳定表达PRL-3的结肠癌Lovo-P细胞和对照组Lovo-C细胞,Western blot检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Snail以及波动蛋白（Vimentin）的水平变化,Transwell小室检测Lovo细胞侵袭能力变化.结果 Lovo-P分别经过TRAM-34和KCNN4-siRNA处理后,侵袭能力明显降低（45.78±3.89比32.69 ±2.15,45.78 ±3.89比28.76±4.25）.Western blot结果提示与对照组比较,TRAM-34处理组E-cadherin蛋白表达上升了69％,Snail蛋白表达下降了36％,而KCNN4-siRNA处理组都E-cadherin蛋白表达上升了57％,Snail蛋白表达下降了30％（P＜0.05）.结论 KCNN4通道蛋白参与了PRL-3诱导结肠癌EMT的过程.

蛋白酪氨酸磷酸酶-3通过诱导肿瘤性巨噬细胞钙离子依赖性钾离子通道表达增强LoVo细胞侵袭性

目的观察结肠癌肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞（M2）相互作用及对肿瘤细胞功能学的改变。方法将转入蛋白酪氨酸磷酸酶．3（PRL-3）的LoVo细胞和M2细胞模拟肿瘤微环境进行共培养，通过Westernblot检测M2细胞钙离子依赖性钾离子通道（KCNN4）蛋白表达，并检测LoVo细胞侵袭性的改变。结果Westernblot检测示PRL-3能通过共培养后诱导M2细胞KCNN4蛋白表达升高，而未作共培养的M2细胞KCNN4蛋白表达未升高。此外，经过共培养后LoVo细胞侵袭性升高（3367±135比1442±89，P〈0．05），而在阻断KCNN4蛋白表达后，LoVo细胞侵袭性降低（1388±87比2893±163，P〈0．05）。结论PRL-3在结肠癌肿瘤微环境中通过提高KCNN4表达从而增强LoVo细胞的侵袭性。

肝素酶通过非阳离子依赖型甘露醇-6-磷酸受体途径对膀胱癌5637细胞侵袭性的影响

目的观察肝素酶与非阳离子依赖型甘露醇-6-磷酸受体（CD222）在膀胱癌5637细胞中的结合及两者结合后对细胞侵袭性的影响。方法应用免疫荧光双染方法研究肝素酶与CD222在膀胱癌5637细胞中定位及结合。设计、合成小于扰RNA（siRNA）-CD222，转染膀胱癌5637细胞。逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Westernblot法检测转染效率。加入人重组肝素酶后采用Westernblot法检测转染前后CD222及磷酸蛋白激酶B（p-Akt）的表达。Transwell侵袭实验检测以上细胞的侵袭性。结果肝素酶与CD222均表达于细胞质。加入人重组肝素酶后5637细胞CD222、p-Akt的表达量及侵袭性显著增强为（79．71±3．25）个，而上述效应在转染siRNA—CD222后明显降低为（49．61±2．88）个，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论5637细胞中肝素酶可与CD222结合，两者共同定位于细胞质。肝素酶通过与其受体CD222细胞外结合可促进Akt磷酸化，进一步促进膀胱癌5637细胞的侵袭。