过表达钾离子通道调节蛋白抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的:检测钾离子通道调节蛋白(K^+ channel regulator,KCNRG)在肝癌细胞中的表达情况,并探讨上调KCNRG基因表达对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力的影响。方法:首先采用RT-PCR、实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测人正常肝上皮永生化细胞THLE-3和肝癌细胞BEL-7402、SMMC-7721、MHCCLM3及SK-HEP1中KCNRG mRNA和蛋白的表达水平。然后采用脂质体转染法将KCNRG过表达质粒KCNRG-pc DNA3.1(+)转染至肝癌细胞SK-HEP1和MHCC-LM3中,同时设置未转染的空白对照组和转染空载体的阴性对照组。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证KCNRG过表达效果后,分别采用细胞计数法、克隆形成实验和Transwell小室法分别检测肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的变化情况,并采用蛋白质印迹法检测肝癌细胞中EMT标志分子的表达变化。结果:肝癌细胞中KCNRG mRNA和蛋白表达水平明显低于人正常肝上皮永生化细胞THLE-3(P值均<0.01),尤以肝癌细胞SK-HEP1和MHCC-LM3中的表达水平最低。KCNRG过表达质粒转染后,肝癌细胞SK-HEP1和MHCC-LM3中KCNRG基因表达水平明显上调(P值均<0.01),N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达水平明显下调(P值均<0.01),E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平明显上调(P值均<0.01),并且2种肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力均被明显抑制(P值均<0.01)。结论:肝癌细胞中KCNRG基因表达水平明显低于正常肝细胞。KCNRG基因表达上调可以抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭及EMT。

抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定

制备抗人FXYD3单克隆抗体(McAb)并鉴定其生物学特性,以固相合成法获得的FXYD3合成多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人FXYD3 McAb。用ELISA、Western Blot、免疫组化技术对抗人FXYD3McAb的亚型、效价、亲和力及特异性进行鉴定。筛选出两段较好的优势抗原表位,分别为NDLEDKNSPFY和KFGQKSGHH-PGETPPLITPGSA。获得四株可稳定分泌抗人FXYD3 McAb的杂交瘤细胞株02A12C4、02F1E8、02E6B10与03A10E11,亚型鉴定重链均为IgG1,轻链为kappa链。间接ELISA法测定效价均在为1∶104以上。其中02F1E8效价为1∶105以上,亲和常数为3.11×108L/mol。免疫组化分析显示了FXYD3均匀分布于肝癌细胞与人胰腺癌Bxpc-3细胞系细胞的胞膜上。结果成功制备了四株抗人FXYD3 McAb,其中02F1E8纯度好、效价高及特异性强。为进一步研究FXYD3在肿瘤组织及细胞系中的表达及临床意义奠定了基础。