禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株毒力及其相关基因的研究

用测定新城疫病毒(NDV)毒力的经典方法,即鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),对源于鸡、鸽、鹅、珍珠鸡、孔雀、鹌鹑和画眉鸟等7种禽(鸟)源的共14个禽Ⅰ型副粘病毒(APMV 1)广西分离株,分别测定了毒力。同时对分离株F基因的N 端前段和HN基因的C 末端片段进行扩增、测序和分析,并绘制系谱树。结果发现,分离株的MDT在36h～75h之间,除1株鸽源毒株gxp22的ICPI值为0外,其余分离株在1 09～1 95之间;除孔雀源的分离株gxpc52在F基因裂解位点附近的氨基酸序列为112R R Q R R F117之外,其它13株均为112R R Q K R F117,都符合强毒株的特征。所有分离株与国内参考强毒株F48E8和国外参考强毒株HER/33在HN基因C 末端终止密码子的位置相同,也符合强毒株的特征。根据F基因核苷酸序列绘制的系谱树发现,近几年来在广西流行的APMV 1毒株的基因型为Ⅶd亚型;根据HN基因核苷酸序列绘制的系谱树表明,广西各种禽源AP MV 1分离株可分为2个群。研究的结果表明,根据F基因裂解位点附近的氨基酸序列和HN蛋白翻译的终止密码子的位置判定APMV 1毒力的结果,都与毒株在临床上的致病情况相符。因此,根据F基因和HN基因序列和结构的特征,均可以判定APMV 1临床分离株的体内致病性。

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。【方法】采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPI)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析。【结果】从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽I型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60h,ICPI为1.45;分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%。【结论】猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。

山东半岛地区高致病力禽Ⅰ型副粘病毒毒株分离与血清学特性研究

分离了山东半岛地区的4株禽Ⅰ型副粘病毒强毒株,并对其血清学特性进行了研究。结果表明:3株鸡源禽Ⅰ型副粘病毒属于强毒株,鸽源禽Ⅰ型副粘病毒对鸡不发病,对鸽则表现为强毒株。

新城疫病毒(禽Ⅰ型副粘病毒)的检测和鉴别

新城疫病毒 (NDV)分离株毒力的巨大差异使得检测NDV对于确诊该病是远远不够充分的 ,因为无致病力的病毒和有毒力的毒株所采取的控制措施是大不相同的。因此诊断需要更多的证据 ,至少要能够说明所分离的毒株是否具有毒力。常规的检测和鉴别NDV方法通常费时费力 ,并需要非常烦琐的体内试验。此外 ,进一步的诊断还需要提供更多有关于来源及其传播的信息。本文集中讨论了单克隆抗体技术和分子生物学技术在诊断该病上的应用。尽管对NDV分离株的毒力验证仍需进行体内试验 ,一套套单克隆抗体株的建立和应用对于鉴定NDV分离株来说仍是一个巨大进步。由于分子生物学技术变得更加简便可靠 ,极有可能取代单抗的应用 ,尤其是那些为了流行病学目的而对病毒所作的鉴定。分子生物学技术的诱人之处在于其可以快速、精确而肯定地在一个试验中同时囊括诊断新城疫 (ND)的三个方面 :病毒的检测、鉴定 (包括对其毒力的推测 )和流行病学。大量基于RT -PCR的技术已被建立起来 ,同时辅以其后的酶切分析、核酸探针杂交以及核酸测序技术。尽管NDV各毒株之间的广泛变异仍然造成了一些技术困难 。

不同基因型禽Ⅰ型副粘病毒致病性及全基因组序列分析

为了解当前流行于鸭群的禽I型副粘病毒的致病性和分子特征,测定分析了两株病毒对不同动物的致病性、病毒的遗传进化地位及其全基因组序列。结果表明,所分离的两株病毒中,M4毒株与疫苗Ulster株同源性最高,为基因I型,基因组全长15 186nt,PX2/03毒株则与近来分离自水禽的FP1/02等高致病分离株的同源性最高,为基因VIII型,基因组全长15 192nt。尽管两株病毒间的基因组核苷酸同源性很高,为92.3%,但二者致病性差异明显,毒株M4感染SPF鸡和鸭均未引起明显发病症状,而PX2/03毒株对1日龄雏鸡、6周龄SPF鸡及不同品种的雏鸭都表现出高致病性。另外,动物感染试验表明,尽管PX2/03毒株对3种鸭的致死性差异不明显,番鸭较半番鸭及樱桃谷鸭对PX2/03毒株更易感。

鸽禽Ⅰ型副粘病毒油佐剂灭活苗免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶⅠ油佐剂灭活苗和ＮＤＶＬａｓｏｔａ 油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽，２０ ｄ 抗体水平达到峰值，在３ ．００ｌｏｇ２ 以上维持３０ ｄ 以上。４０ ｄ 后用鸽Ａ／ＰＭＶⅠ和ＮＤＶＦ４８Ｅ９ 分别进行攻击，对于ＮＤＶＦ４８Ｅ９ 的攻击，保护率均为１００ ％ ，对于鸽Ａ／ＰＭＶⅠ的攻击，鸽Ａ／ＰＭＶⅠ油佐剂灭活苗保护率为１００ ％ ，ＮＤＶＬａｓｏｔａ 油佐剂灭活苗保护率为６６．７ ％ 。田间试验，抽检４８ 份血样，抗体平均为４ ．

鸽禽Ⅰ型副粘病毒病研究概况

鸽禽Ⅰ型副粘病毒病,俗称鸽新城疫,最早见于20世纪70年代末的报道,80年代逐渐成为一种世界性的鸽病。据查阅近十多年来国内有关鸽病的文献资料423篇,进行综合分析的结果表明,鸽病毒性传染病是各类鸽病中发生频率最多、危害性最大的一类传染病,占查阅文献的40.19％(170/423),而国内在80年代初期开始出现的鸽禽Ⅰ型副粘病毒病,逐年都有上升的趋势,现已广泛流行于国内各省区。

来自5种动物禽Ⅰ型副粘病毒HN基因的序列分析

本研究对从广西5种不同动物体内分离到的禽Ⅰ型副粘病毒毒株,进行了HN基因的扩增、克隆和序列分析.5个APMV-Ⅰ分离株HN基因的核苷酸序列同源性为94.7％～98.4％,推导氨基酸序列同源性为96.3％～99％,同源性较高；5个毒株的HN基因与国内广东、山东、福建等地的当前流行株同源性较高,但与经典毒株同源性较低；遗传分析表明HN基因相对保守,都源于同一个基因亚群.

鸽禽Ⅰ型副粘病毒病蜂胶佐剂灭活疫苗的研制

鸽禽I型副粘病毒 (A/PMV_I)病是鸽的一种严重病毒性传染病 ,给养鸽业造成了巨大损失。为了更好地预防本病的发生 ,我们用从现场分离鉴定的 7株鸽A/PMV_I毒株中筛选出 3株抗原性良好的毒株作为种毒 ,研制成蜂胶佐剂混合毒株灭活疫苗 ,经安全试验、最佳免疫剂量测定、效力试验 ,以及田间应用的结果 ,表明该疫苗抗原性良好、使用安全和免疫保护效果确实。实验室试验 ,用本疫苗免疫后 30、90、180天 ,其保护指数分别为 10 0 %、77 8%和 5 5 6 %,免疫有效期最少达 6个月 ;在4℃～ 8℃保存 ,其有效期最少可达 180天。

鸽禽Ⅰ型副粘病毒病复合中药佐剂灭活疫苗的研制

鸽禽Ⅰ型副粘病毒(A/PMV-Ⅰ)病是鸽的病毒性传染病,给养鸽业造成了巨大损失.为了更好地预防本病的发生,我们用从现场分离鉴定的23株鸽A/PMV-Ⅰ毒株中,筛选出3株抗原性良好的毒株作为种毒,研制成以蜂胶、黄芪、人参、扶芳藤为主的复合中药佐剂灭活疫苗.经安全试验、最佳免疫剂量测定、效力试验,以及田间应用的结果,表明该疫苗抗原性良好、使用安全和免疫保护效果确实.实验室试验,用本疫苗免疫后60,90,120,150,180d,其保护指数分别为100%,100%,100%,94.4%,88.9%,免疫有效期可达6个月以上;在4～8℃下保存,其有效期最少可达180d.

八株禽副粘病毒Ⅰ型的生物学特性和免疫原性

为了解禽副粘病毒Ⅰ型不同毒株的某些生物学特性,测定了分离于三黄鸡、乌骨鸡、孔雀、鹅、鸭等不同宿主的7株禽副粘病毒的血凝特性、血凝解脱时间、鸡胚半数致死量、脑内致病指数、静脉致病指数,并与新城疫病毒强毒株F48E8进行了比较。结果显示,7株禽副粘病毒的毒力除分离自鸭的1株Y01属于弱毒株外,其余6株的毒力均与F48E8相当。为筛选具有优良免疫原性的禽副粘病毒Ⅰ型病毒株,用包括F48E8在内的8株病毒分别制备油乳剂灭活疫苗,免疫40日龄SPF鸡,用21 d后的血清进行交叉血凝抑制试验,用免疫鸡进行交叉攻毒试验。由交叉血凝抑制价计算出的“优势”标准(D)和交叉攻毒保护结果得知,8株禽副粘病毒的免疫原性有很大差异,SHJ00对8株禽副粘病毒的D值均大于、等于1.0,有较高的攻毒保护率,免疫原性最佳;F48E8、SHJ02、E01、KQ02、Y03、Y01依次降低;WG J02对其它7株病毒的D值均小于1.0,攻毒保护率最低,免疫原性最差。这一结果为研制对该病有效的疫苗打下了基础。

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3′端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因 (F基固 )cDNA序列 ,设计并合成了 1对引物 ,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97 1株的核酸 (RNA)为模板 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对其融合蛋白基因 3′端进行扩增 ,获得了预计的 884bp左右的片段。将该片段克隆进 pGEM TEasy质粒载体 ,获得重组质粒T GPMVF3′ ,采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定 ,证明所克隆的片段即为目的基因片段 。

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用RT－PCR技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒GD／P1分离株F0裂解位点附近884bp的F基因cDNA片段，并将其克隆到pGEM－TEasy质粒中，获得了重组质粒T－pPWV－F－I，核酸序列测定和分析表明，该片段与新城疫病毒强毒株F48E9和HER／33相应区域的同源性分别为87．5％和88．19％，与新城疫病毒弱毒株LaSota和B1株的同源性分别为83．83％和84．15％．该病毒F0裂解位点的氨基酸序列为Arg－Arg－Gln－Lys－Arg－Phe－Ile－Gly－Ala．这在分子水平上证明该毒株较接近于新城疫病毒强毒。

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH_(99)V株F基因的克隆和序列分析

从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒,经鉴定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板,用RT-PCR一步法扩增出其F基因的cDNA序列,然后将其克隆至pMD18-T载体中,对其进行序列测定。结果表明,所克隆的基因片段长度为1 750 bp,含有1个1 662bp的开放式阅读框架(ORF),编码553个氨基酸。将YH99V株F基因序列和推导的氨基酸序列与国内外新城疫毒株的F基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在82.7%-99.6%,氨基酸序列同源性为87.2%-99.3%。YH99V株在F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与弱毒株在这一区域的序列完全相同,表明为弱毒株。根据F基因的全核苷酸序列,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株F基因的系统发育树。分析结果显示YH99V株与Lasota等参考毒株同属于基因Ⅱ型,表明它们具有较近的亲缘关系。

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH_(99)V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中,从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒,经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型,命名为YH_(99)V株。以YH_(99)V株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段,然后将其克隆至pMD18-T载体中,对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp,该基因的ORF总长为1734bp,编码577个氨基酸。将YH_(99)V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在82．1%～99．7%,氨基酸序列同源性为87．2%～99．5%。在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。

禽I型副粘病毒广西分离株F基因序列及毒力的研究

对源于鸡、鹅、鸽的 9株APMV_1广西分离株及我国常用的中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )的F基因N_端前段进行了RT_PCR扩增 ,产物进行核苷酸序列测定 ,用基因分析软件DNAStar进行分析并与已发表的其它参考毒株进行比较。结果发现 ,广西分离株在裂解位点的氨基酸组成和排列均符合强毒株的特征 ;根据F基因绘制的系谱树来看 ,广西鸡和鹅分离株都归属于基因型VII,证实近年来广西流行的基因型与国内其他地区的相同 ;并发现中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )也属于基因型VII。研究还对分离株进行了常规的毒力和致病性测定试验 ,并与根据F基因序列特征判定的结果相比较 ,结果发现其中一株鸽源和两株鹅源分离株根据常规方法判定的结果与毒株在临床上的致病性不相符 。

鸽禽I型副粘病毒油佐剂灭活苗对肉种鸽免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶ－１ＳＸ株（简称ＳＸ株）制成的油佐剂灭活苗与ＮＤＶ油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽，免疫后２０天抗体水平达到峰值，抗体水平在３ｌｏｇ２以上维持３０天以上。免疫后４０天用鸽ＳＸ株和新城疫强毒对两种疫苗免疫鸽分别进行攻击，两种疫苗免疫组对ＮＤＶ强毒攻击的保护率均为１００％，鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率为１００％，而ＮＤＶ油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率仅为６６７％。鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗田间试验抽检４８份肉种鸽血清，抗体平均值为４３０±１１６ｌｏｇ２。