禽呼肠孤病毒在我国部分地区蛋鸡群中的血清流行率和风险因素分析

禽呼肠孤病毒(ARV)在我国流行范围较广,感染家禽后使其出现病毒性关节炎、生长不良和产蛋量下降等表现,对我国养禽业造成较严重的经济损失。为了解我国蛋鸡群中ARV的流行情况及存在的感染风险因素,本试验在2022年11月—2023年3月从北京、天津、河北、山东、河南、江苏、陕西、湖北和重庆9个省市的45个蛋鸡养殖场(其中包括祖代蛋鸡群、父母代蛋鸡群和商品代蛋鸡群),收集共计45份调查问卷和968份血清样本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的ARV抗体,并结合调查问卷,采用单因素分析和逻辑回归分析方法找到蛋鸡出现ARV感染症状的风险因素。ELISA检测结果显示,968份血清样本中检出阳性863份,阳性率为89.15%(95%CI:87.0%~91.0%);单因素分析结果显示,全进全出饲养模式下的蛋鸡出现ARV感染症状的概率显著低于区域性全进全出饲养模式或不同日龄、不同批次混养饲养模式下的蛋鸡,且具有较强程度的关联(P<0.05,0.1<OR<0.3);生物安全防控严格的大、中型规模化养殖场(5万只以上)的蛋鸡出现ARV感染症状的概率显著低于生物安全防控存在不足的小型养殖场(2万~5万只)的蛋鸡,且具有较强程度的关联(P<0.05,0.1<OR<0.3);员工不注意对鸡舍消毒的养殖场饲养的蛋鸡出现ARV感染症状的概率显著高于员工对鸡舍具有较强或一般消毒意识的养殖场饲养的蛋鸡,具有中等程度的关联(P<0.05,1.5<OR<3.0)。综上所述,饲养模式、养殖场规模和员工对鸡舍的消毒意识可能是产蛋鸡群感染ARV的风险因素。

一株基因Ⅲ型禽呼肠孤病毒变异株的分离及其灭活疫苗免疫原性初步评价

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病性、血清交叉中和能力及灭活疫苗免疫抗体水平检测,分析其致病性、抗原性和免疫原性。结果显示:成功从病鸡关节组织中分离到1株ARV,命名为ARV-HLJ21-1690401,该分离株位于基因Ⅲ型分支,与基因Ⅲ型参考株ISR5233和42563-4-2005遗传距离较近,氨基酸序列相似性为83.4%和81.7%,而与其他基因型分离株遗传距离较远;该分离株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性,可引起接种鸡胚90%死亡,接种6周龄SPF鸡可引起100%发病;该分离株具有良好的免疫原性,其制备的灭活疫苗免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平。综上所述,研究成功分离到一株具有致病性和良好免疫原性的基因Ⅲ型ARV变异株,为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要理论依据。

基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定

为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。

禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

为建立检测禽呼肠孤病毒(ARV)血清抗体阻断ELISA方法,试验采用浓缩的ARV-AH20株病毒粒子免疫5周龄BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过间接ELISA和免疫荧光试验(IFA)进行阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选,获得两株稳定分泌针对σC蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株H9B2D77、B4E4B10。选择H9B2D77株作为检测抗体、重组σC蛋白作为包被抗原,经条件优化,建立了一种检测ARV抗体的阻断ELISA方法。结果显示:该方法与常见鸡源病原的抗体阳性血清均不存在交叉反应,批间和批内变异系数均小于6%;对48份鸡血清样品的检测,该方法与IFA具有100%的总体符合率。综上所述,基于禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法特异性高,重复性好,可用于ARV抗体检测。

变异型高致病性鹅源禽呼肠孤病毒的分离和鉴定

为了探究2020年江苏省扬州市江都区某鹅场发生的1起以肝脏和脾脏出血为典型病变特征的急性传染病病因,本试验采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测病死鹅肝脏和脾脏研磨液中禽呼肠孤病毒(ARV)的感染情况,将聚合酶链反应(PCR)阳性病料进一步进行病毒的分离、鉴定、血凝性和致病性测定及遗传进化分析。结果显示,鸡胚中分离的病毒为ARV,将其命名为ARV-JSJD-2020;该病毒分离株接种鸡胚24 h后即可致其死亡;能感染Vero细胞产生细胞病变;没有血凝活性;鸡胚半数致死量(ELD50)为10^(-4.166)/0.2 mL;动物回归试验中雏鹅24 h即出现死亡现象,肝脏主要病变为局灶性坏死;σC基因序列分析显示,该分离株分类上属于水禽源呼肠孤病毒分支,但与目前疫苗株的亲缘关系较远。结果表明,本试验分离得到的ARV-JSJD-2020可以为后续鹅源ARV的防控和疫苗的研发提供参考依据。

禽呼肠孤病毒的分子特征和复制周期

禽呼肠孤病毒是Orthoreovirus属5种病毒之一,该属还包括非致融哺乳动物呼肠孤病毒、致融哺乳动物呼肠孤病毒和狒狒呼肠孤,以及从爬行动物中分离的致融病毒。禽呼肠孤病毒和哺乳动物呼肠孤病毒是Orthoreovirus属的两个主要类群,尽管它们有许多共同的分子特征和物理化学特征,但它们在宿主范围、致病性和基因组编码能力以及各种生物学和血清学特性方面有所不同。

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒（ARV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切，得到线性化转录模板DNA，将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板，用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物，以体外转录的RNA作为标准品，应用SYBRGreenI染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，比常规的RT-PCR敏感1×10^3倍，可检测到5．2×10^2个拷贝的标准品RNA，与NDV、IBDV、MG均不反应；从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒，病毒含量为1×10^5～1×10^7个拷贝／μL.表明，建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于ARV的检测。

禽呼肠孤病毒广西分离株σ_3基因的克隆和表达

采用RT_PCR技术扩增禽呼肠孤病毒广西分离株R1σ3基因,将σ3基因克隆至PGEX_4T_1载体上,测序结果表明插入的片段为σ3目的基因。切下目的基因σ3,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白质粒表达载体PGEX_4T_1,获得重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定,表达σ3基因插入的位置,大小和阅码框架均正确,表明成功构建了融合表达载体PGEX_R1_σ3。构建好的重组质粒,经1mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中得到了表达。融合蛋白GST_R1_σ3的分子量为60ku,以包涵体形式存在。Westernblot分析表明,融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定

利用反转录 聚合酶链 (RT PCR)技术 ,扩增出禽呼肠孤病毒 (ARV )S113 3、173 3长为 5 40bp的S1基因片段。将扩增到的这 2个毒株的S1基因通过粘端连接分别克隆到pBluescriptⅡKS +质粒中 ,用PCR和限制性内切酶分析鉴定 ,表明获得 2种重组质粒ARVS113 3S1 pBluescript、ARV 173 3S1 pBluescript。

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法，根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列，设计合成两对引物，用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物，而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性；该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒 (ARV)S1 1 3 3株S1基因序列 ,设计合成了一对扩增跨幅为 5 3 2bp的引物。这对引物对ARV标准株、分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT_PCR扩增 ,即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV 4个标准株和 5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT_PCR产物 ,而对照样品的扩增全为阴性 ;该方法最低可检测到 0 .1 6ng的ARVRNA ,还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARVRNA。表明该一步法RT_PCR对于ARV的检测是可行的。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

应用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因的研究

根据禽呼肠孤病毒 S1133毒株 S1基因序列 ,设计合成 XZ11、XZ12和 XZ11、XZ33两对引物 ,用半套式 PCR对 6株禽呼肠孤病毒标准毒株的核酸进行了检测。结果 6株 ARV均可扩增出和预期大小相符 392 bp的 PCR产物 ,而对其他 6种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性 ;该半套式 PCR比 RT- PCR更加敏感 ,这种方法可以检测出 1fg的 ARV

禽呼肠孤病毒σ_2基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株和广西分离株R 1的2σ基因。将2σ基因克隆至PGEX-4T-1载体上,测序结果表明,插入的片段为2σ目的基因。切下目的基因2σ重组到含有谷胱甘肽(G ST)的融合蛋白质原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒。经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表达2σ基因插入的位置、大小和读码框架均正确,表明成功构建了融合表达载体PGEX-S1133-2σ和PGEX-R 1-2σ。构建好的重组质粒,在大肠杆菌JM 109α中经1 mm o l/L IPTG诱导得到了表达。融合蛋白G ST-2σ和G ST R 1-2σ的相对分子质量为65 100,以包涵体形式存在。W estern-b lot分析表明,融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。

中国禽呼肠孤病毒番鸭分离株的纯化及其核酸与结构蛋白分析

将番鸭呼肠孤病毒国内分离株在番鸭成纤维细胞 (DEF)上克隆纯化 3次后 ,在鸡成纤维细胞 (CEF)上增殖 ,收获的细胞培养物经 3次冻融 ,采取差速离心、超速离心、非线性蔗糖密度梯度离心和脱糖处理相结合的方法进行提纯 ;对不同梯度区带的蛋白提取物经电镜观察、毒价(TCID50 )和含毒量测定得到病毒纯化物 ;最后对病毒纯化物进行琼脂糖核酸电泳和SDS PAGE蛋白电泳分析。结果 ,核酸电泳得到 10条RNA带 ,分列呈“334”形式的 3组 ,其迁移率除M 3基因外无明显差异 ;蛋白电泳得到分子质量分别为 14 9.0、12 9.0、111.0、79.0、75 .0、5 0 .0、4 2 .0、39.0、37.0、35 .9、32 .0、2 9.0ku的 12条蛋白带 ,其中 5个蛋白的分子质量与参考株S1133相近。该分离株具有禽类呼肠孤病毒核酸和蛋白电泳图谱的共同特征。

重组禽呼肠孤病毒S1133σ3基因表达及其免疫原性研究

【目的】构建禽呼肠孤病毒(ARV)S1133σ3基因的真核重组质粒,研究其表达蛋白的免疫原性,为研发ARV基因疫苗奠定基础。【方法】采用RT-PCR对ARVS1133毒株的σ3基因进行RT-PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后,转化大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒的DNA,经双酶切、PCR扩增鉴定和纯化。以阳性重组质粒pcDNA3.1-σ3免疫7日龄SPF雏鸡,同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照,二次加强免疫两周后,采用Westernblotting检测鸡群血清抗体;并用S1133毒株进行攻毒,4d后进行ARV检测。【结果】重组质粒pcDNA3.1-σ3的双酶切和RT-PCR扩增鉴定结果一致,均能扩增出约999bp目的条带;免疫攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%,pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P<0.05),但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P>0.05);病毒检出部位最高是关节,其次是胸腺和肾脏,胸腺检出率为零。【结论】真核表达ARVS1133σ3蛋白具有较好的免疫保护,可作为免疫抗原进行下一步的疫苗中和试验。

利用σ3和σ2重组蛋白检测禽呼肠孤病毒抗体ELISA的建立

将纯化好的两个ARV结构蛋白σ3和σ2作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9.5、12.0μg/mL;一抗血清的稀释度为1∶200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1∶5000,初步建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的ARV SPF鸡阳性血清进行检测,结果阳性检出率分别为90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。

禽呼肠孤病毒分离株δ_3蛋白基因克隆及序列分析

本研究将禽呼肠孤病毒广西两分离株R1、R2和美国分离株Isol S1基因中编码σ_3蛋白的基因片段进行克隆和鉴定。对克隆片段测序后与参考株S1133、1733、138、176毒株的S1基因相应序列进行比较分析。结果表明,广西分离株R1、R2与美国分离株Isol以及S1133、1733、176毒株的核苷酸和推导氨基酸的同源性均在95％以上,上参考株138的同源性在81％～85％之间。由此可见,除了与138参考株外,广西分离株R1、R2和美国分离株Isol与其他比较的毒株的S1基因上存在很大的相关性。