PCR结合斑点杂交技术检测禽多瘤病毒方法的建立及应用

鹦鹉幼雏病是由禽类多瘤病毒(APV)引起的多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病,严重危害鹦鹉养殖业的健康发展。为提高分子生物学方法检测APV的敏感性和特异性,对APV基因片段进行克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以VP1基因为模板,经PCR扩增获得731 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记,制备用于检测APV的特异性核酸探针;对制备的探针进行灵敏度检测,同时与普通PCR进行敏感性比较;使用制备的探针,对经分离鉴定和制备保存的其他7种禽病毒核酸进行特异性检测;用该核酸探针,对疑似感染APV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的APV进行全基因组扩增和序列分析。结果显示:该探针可检测到2 pg量的APV特异性核酸片段;仅APV-VP1阳性核酸显色,呈现阳性反应,而阴性核酸和其他7种禽病毒核酸均不显色,呈阴性反应。结果表明:建立的核酸斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于临床初步诊断。本方法的建立为我国开展APV分子流行病学调查及其感染的临床诊断提供了技术支撑。

鹦鹉禽多瘤病毒陕西株VP1基因的克隆及荧光定量PCR检测方法的建立

为了解鹦鹉禽多瘤病毒(APV)陕西分离株(SX-2018株)VP1基因的分子特征,并建立可用于临床的快速灵敏的APV检测方法,本研究通过PCR扩增了SX-2018株VP1基因序列,并与22株国内外参考株进行了核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果显示:扩增的SX-2018株VP1基因全长为1032 bp,与其他APV分离株核苷酸相似度为99.1%~100.0%;遗传进化分析显示SX-2018株属于CladeⅡ分支。设计针对VP1基因的特异性引物(209 bp)并构建其相应的质粒标准品,以不同浓度的该质粒标准品为模板扩增并绘制了标准曲线,通过条件优化建立了APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法仅特异性扩增APV,与鹦鹉其它常见病毒无交叉反应,特异性强;对质粒标准品检测的最低浓度达5.4×101拷贝/μL,为常规PCR的100倍;组内组间变异系数分别小于0.5%、1.5%,重复性好。利用该方法与常规PCR方法对疑似APV感染的30份样品进行检测并比较,结果显示:建立的APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法与常规PCR的符合率为86.67%,且阳性检出率高于常规PCR。本研究为我国鹦鹉APV的分子流行病学调查提供了参考数据,为在鹦鹉群中开展该病的筛查提供了有效的技术手段。

一株禽多瘤病毒的分离鉴定及其VP1基因序列分析

从陕西某养鸟场发病鹦鹉幼雏体内分离到1株禽多瘤病毒(201808SX株),该病毒能在7日龄SPF鸡胚上繁殖,并呈现明显的胚体病变。通过克隆测序,获得了禽多瘤病毒(201808SX株)VP1基因全基因序列。同源性分析表明,201808SX分离株与不同地区不同时间APV分离株的VP1基因核苷酸同源性均较高,不低于99.4%,与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株和2018年中国C4-15分离株等同源性最高,均为100%。遗传进化分析表明,201808SX分离株在遗传进化上与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株、2018年中国C4-15株、2010年波兰分离株和2016年葡萄牙分离株处于同一小分支,均属于CladeⅡ分支。这是国内首次报道,将临床病料组织上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚成功地分离到APV,这为BFD的研究和防控奠定基础。试验结果也首次证实陕西地区虎皮鹦鹉中存在APV感染,丰富了国内APV流行的基础数据。

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据Gen Bank已发表NDV的F基因序列(Gen Bank登录号JX840454)和APV的F基因序列(Gene Bank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(La Sota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(Gen Bank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(Gen Bank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。

禽肺病毒研究进展

禽肺病毒（Avianpneumovims，APV）在上世纪70年代于南非首先分离到，随后研究证实APV存在A、B、C、D4个亚型。APV可以感染多种禽类，可导致感染动物鼻气管炎、肿头征、产蛋下降等疾病，给禽类养殖造成严重的危害。目前已经建立了一套成熟的APV检测系统，但由于APV在感染的宿主体内存活的时间很短，而且主要出现在疾病的早期，这给病毒的分离了很大的困难。目前，对APV致病机理和防制还缺乏足够的认识。因此，本文主要从APV病原学、病原检测和分离、致病机理、防控等方面的研究介绍目前对APV研究的进展。

禽多瘤病毒VP4蛋白单克隆抗体的制备及其间接免疫荧光检测方法的初步建立

为制备禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)VP4蛋白单克隆抗体,初步建立APV的间接免疫荧光检测方法,本研究通过原核表达APV VP4蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以制备的VP4单克隆抗体为一抗,FITC-山羊抗小鼠IgG为二抗,优化反应条件。结果表明,筛选获得15株阳性细胞株,经亚型鉴定,其中2株单克隆抗体的重链为IgG2b类型,13株重链为IgG1类型,轻链均为κ型。选择3株细胞制备单克隆抗体,这3株抗VP4单克隆抗体浓度分别为2.9、2.6、3.2 mg/mL;亲和常数分别为1.06×10^(10)、2.95×10^(9)、9.60×10^(9)。其中两株效价均为1∶204800,另一株的效价为1∶51200。经Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,这3株单克隆抗体均能与APV发生特异性反应;本研究建立的间接免疫荧光检测方法的最适条件为:Anti-A-VP4-151∶1000倍稀释,4℃条件下过夜孵育,二抗1∶200稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的方法检测细胞中的减蛋综合征病毒(EDSV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和APV,只有APV的检测结果显示阳性,检测其他病毒的结果均为阴性。应用该单克隆抗体建立的间接免疫荧光方法在细胞上能检出至少5 TCID50 APV感染。本研究制备的单克隆抗体和建立的间接免疫荧光方法为APV感染的流行病学调查和实验室诊断奠定了基础。

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_(t)值与标准品在1.0×10^(9)~1.0×10^(2)copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。

小太阳鹦鹉禽多瘤病毒感染病例分析

目的确诊某宠物鹦鹉饲养场的小太阳鹦鹉幼雏发生大规模发病死亡疫情的病原.方法对送检的发病幼雏进行临床剖检及病理组织学观察,取其肝脏组织提取DNA进行禽多瘤病毒、喙羽病病毒、腺病毒核酸检测.结果发病鹦鹉均以肝坏死、肠道出血等消化系统病变为主,胸腺、法氏囊等免疫器官也有一定程度病理损伤.病原检测结果显示所有发病鹦鹉均为禽多瘤病毒阳性,喙羽病病毒、腺病毒阴性;对PCR扩增产物测序后分析显示,该分离株与台湾流行的鹦鹉禽多瘤病毒同源性最高.结论该病例的发现提示我国应加大对宠物鹦鹉禽多瘤病毒的检测力度,防止输入性感染,鹦鹉饲养场应进行禽多瘤病毒净化,并采取有效的生物安全措施防止带毒鹦鹉的引进.

鹅源禽痘病毒的鉴定和基因分析

2016年6月,广西邕宁某场有20%的阳江鹅在喙、眼和脚出现赘肉状痘癍,临床无死亡病例。为了研究此病的病原和基因特征,采集痘癍样本、制备病理组织切片进行显微镜观察、并利用透射电镜进行形态学分析以及TaqMan荧光定量PCR检测,证实其病原为禽痘病毒属(Avipoxvirus,APV)成员,命名为YNE。通过对病毒核芯蛋白P4b编码基因(fpv167)和DNA聚合酶Popr编码基因(fpv094)的部分序列串联进行比对,发现该毒株与1991年分离于北美林鸳鸯的APV高度同源,属于A5.2基因分支。进一步序列分析发现,该毒株与同期发生在该场的麻鸭源APV相应序列的同源性可达99.9%,初步证实该病毒可以在鸭鹅间跨种传播。

山东省3家鹦鹉养殖场多瘤病和喙羽病的病原检测与序列分析

2018年山东省某养殖场发生大量幼龄鹦鹉死亡事件,疑似为病毒感染。为探寻病因,开展了该场及省内另外两个鹦鹉养殖场的流行病学调查。利用PCR技术对临床样品中提取的DNA或RNA进行检测,结果发现新城疫与禽流感病毒均呈阴性,而禽多瘤病毒(APV1)与鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)呈现为强阳性,由此推断此3个鹦鹉养殖场存在APV1和PBFDV感染,平均病毒检出率分别为67.9%与71.4%,共感染检出率率为58.0%。对阳性样品进化全基因分析发现:区域内的PBFDV流行毒株同源性高,与该地区早期报道的毒株亲缘关系较为接近;APV1的VP1基因同源性较高,与欧洲分离毒株亲缘关系较为接近,说明我国流行的APV1或来源于进口鹦鹉。本研究警示,需要加强鹦鹉疾病防控,严格鹦鹉进出口检疫,并制定和健全标准的鹦鹉病检疫程序。