H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^(-4)至2.56×10^(-5)之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验(HI)显示血凝抑制活性,其(HI)效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6400、1∶25600和1∶25600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验(HA)相当,与其他亚型AIV(H1、H3、H5、H7),以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。

H9N2亚型禽流感病毒灭活苗最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究

H9N2亚型禽流感疫苗在我国普遍使用,在强大免疫压力下,H9N2亚型禽流感病毒变异加快,现有商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。为此,本研究以从近期流行毒株中筛选出的一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(简称为SH441)为种毒,制备灭活苗,进行了最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究。将制备的H9N2亚型禽流感灭活苗以0.01、0.02、0.04、0.05、0.08 mL/只的不同剂量,胸部肌肉途径免疫3周龄SPF鸡只,并于免疫后21天静脉感染SH441病毒,结果显示该疫苗最小免疫剂量为0.02 mL/只。以0.05 mL/只剂量免疫SPF鸡只,该疫苗能刺激SPF鸡只产生较高的HI抗体滴度,且在免疫后第5周达到峰值(12 Log2以上),随后稍有下降但保持相对稳定,且在免疫后29周时依然保持在7 Log2以上。这些结果为为该疫苗的进一步开发奠定了良好的基础。

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

为了解不同年分离的H9N2亚型禽流感病毒（Avian infl uenza virus,AIV）之间的抗原相关性,挑选2002年、2006～2014年在上海市分离的14株H9N2亚型禽流感病毒,通过血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）交叉试验进行抗原性比较和分析。HI试验结果显示,2002年,2006～2014年这14株H9N2亚型AIV不同毒株间已经发生了抗原漂移,划分成4个不同的抗原群,A/Chicken/Shanghai/Y1/2002和A/Chicken/Shanghai/Y1/2006归为一个抗原群,A/Chicken/Shanghai/C/2011独自成为一个抗原群,A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013、A/Chicken/Shanghai/1107/2013归为同一个抗原群,其余毒株均为一个抗原群。综上所述,随着时间的推移,H9N2 AIV抗原发生了不同程度的漂变,但是也存在在某个时间段多种抗原群共存的情况。该研究结果从理论上为上海市制定禽流感防控策略,有效防制H9N2 AIV流行提供了科学的指导,为生产H9N2亚型流感免疫与疫苗候选毒株的选择提供参考依据。

H9N2禽流感病毒纳米抗体酵母双杂交文库的构建

【目的】构建H9N2禽流感病毒(AIV)纳米抗体(Nbs)酵母双杂交文库,为后期筛选H9N2 AIV Nbs奠定基础。【方法】以H9亚型禽流感疫苗(F株)免疫双峰驼,当血凝抑制(HI)抗体滴度大于1∶2~4时,颈静脉采集血液,分离淋巴细胞并提取淋巴细胞总RNA,用反转录试剂盒合成第一链cDNA,再以此为模板,通过巢式PCR扩增Nbs基因片段。将Nbs基因与pGADT7-Rec载体共转至Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30℃倒置培养约4 d,收集平板上的全部菌落,构建H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,并对文库库容、滴度、重组效率和多样性进行鉴定。【结果】经H9亚型禽流感疫苗连续免疫4次后,双峰驼HI抗体滴度可达1∶2~9;通过巢式PCR成功扩增出400 bp的Nbs基因。对构建的H9N2AIV Nbs酵母双杂交文库的鉴定表明,其库容为2.4×10~8,滴度为4.2×10~9 CFU/mL,插入重组率为95.6%;随机挑取10个克隆测序,结果显示均符合Nbs序列特征,且为独立克隆,表明文库多样性良好。【结论】成功构建了H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,且文库各项指标均达到了要求。

深圳市不同人群和鸡群感染禽流感病毒H9N2亚型状况研究

目的分析禽流感病毒H9N2亚型毒株在深圳市不同人群和鸡群中的感染状况。方法采用常规的鸡胚双腔法分离流感病毒;采用红细胞凝集抑制试验(HI)和中和试验测定流感病毒抗体。结果从深圳市农贸市场300只鸡只样本中分离到27株H9N2亚型流感病毒,其抗体阳性率为7%,但未能从人群中分离到H9N2亚型流感病毒。人群血清中其抗体阳性率与职业高度相关,与鸡只密切接触的人群明显高于非密切接触的人群。结论禽流感病毒H9N2亚型对人群和鸡群均易感,可通过近距离的密切接触传播;推测人所感染的H9N2可能主要来源于鸡只等家禽。

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。

H_9N_2亚型禽流感病毒灭活苗最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究

H9N2亚型禽流感疫苗在我国普遍使用,在强大免疫压力下,H9N2亚型禽流感病毒变异加快,现有商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。为此,本研究以从近期流行毒株中筛选出的一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2）（简称为SH441）为种毒.

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N25亚型禽流感病毒基因组进行扩增，测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析，旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点，为该病的综合防控提供依据。

囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响

为研究囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响,将200只鸡分为疫苗组、疫苗+囊素组、囊素组和对照组,每组50只。从13日龄起每7 d测定其法氏囊指数、禽流感(H9)HI抗体水平。结果表明:囊素肽能提高禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫后的抗体水平,并延长高水平抗体的维持期,能显著地促进法氏囊的生长发育。

高抗体水平肉种鸡H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析

从抗体水平较高、产蛋下降的种鸡群分离到一株具有血凝特点的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名A/Chicken/Shandong/LY/08,病毒对SPF鸡无致病性,IVPI为0。对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点的基序为RSSR↓GL,与弱毒基序一致。A/chicken/Shandong/LY/08分离毒株与GenBank上发表的山东参考株HA基因的核苷酸之间的同源性为95.2%～99.6%,氨基酸序列之间的同源性为95.4%～99.5%。与国外A/ck/Korea/ms96/96、A/Parakeet/chiba/1/97和A/turkey/Wisconsin/1/1966 HA基因核苷酸序列同源性为82.6%～91.6%,氨基酸序列同源性为87.9%～92.2%。系统进化树分析表明,该毒株与近年来国内流行的H9N2禽流感毒株类似。

2013～2015年湖北省规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感疫苗免疫效果调查

禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)感染禽类引起的一种高度接触性传染病,临床表现为从呼吸系统到全身严重败血症等多种症状。为了解近年来湖北省H9N2亚型禽流感疫苗的免疫效果,2013年6月到2015年12月从湖北省规模化蛋鸡场随机采取样本共6648份,用血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)测定了H9N2亚型禽流感抗体滴度。对不同月份样本进行分析显示,2013年8月平均抗体滴度最低为8.7 log2,10月的平均抗体滴度最高为9.44log2,但依然小于2014和2015年的最小平均抗体滴度。2014年1月的平均抗体滴度最低(9.62 log2),5月的平均抗体滴度最高(12.34 log2),2015年的6月平均抗体滴度最低(10.24 log2),11月平均抗体滴度最高(13.03 log2);对不同日龄样本进行分析显示,蛋鸡的平均抗体滴度随着日龄的增加而增加,不同阶段的蛋鸡的抗体滴度平均值呈现递增现象,且都大于9 log2,但是在120<日龄≤200的蛋鸡中抗体滴度部分值小于4 log2,存在着离散度大,极差大的特点;3年的平均抗体滴度对比显示,2013~2015年平均抗体滴度呈现递增现象,且都大于9 log2。检测结果显示,H9N2亚型禽流感疫苗的总体免疫效果良好,能达到保护鸡群受同种毒株感染的目的,但是不同月份、不同日龄的平均抗体滴度存在差异。

三源重组H9N2亚型禽流感病毒NA蛋白原核表达及多克隆抗体制备

目的利用原核表达系统表达华南地区分离的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法将1株H9N2亚型AIV的NA基因克隆到pET-32a载体,构建NA原核表达质粒,并转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行蛋白表达。优化IPTG浓度、诱导时间和温度,提高蛋白表达量。利用镍柱纯化重组NA蛋白,并免疫新西兰兔,制备兔抗NA蛋白多克隆抗体通过Western blot和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)验证多克隆抗体的特异性。通过间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定多克隆抗体的效价。结果成功构建了pET-32a-H9N2-NA原核表达质粒;经SDS-PAGE和Western blot验证,表达的重组NA蛋白大小约70 ku,符合预期;对诱导条件进行优化,确定37℃,终浓度为1.2 mmol/L的IPTG,诱导时长6 h为最佳条件;制备的兔抗NA蛋白多克隆抗体的Western blot和IFA的结果显示,该多克隆抗体能和H9N2亚型AIV结合,特异性好;间接ELISA测得兔抗NA蛋白多克隆抗体的效价达到了1∶409600。结论本研究表达的NA蛋白,制备的兔抗NA蛋白多克隆抗体具有特异性,效价高,为NA蛋白的ELISA检测方法的建立和疫苗研制提供帮助。

抗H9亚型禽流感病毒血凝素广谱单克隆抗体的筛选与鉴定

本研究通过血凝抑制实验和间接免疫荧光实验,在前期利用表达H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(SH441)血凝素(HA)基因的真核表达质粒免疫小鼠,成功获得多株抗H9亚型HA蛋白的单克隆抗体中,筛选到4株与2009-2015年间分离到的H9N2 AIV具有良好反应性的单克隆抗体;中和实验表明,这4株单抗均对SH441毒株具有中和活性;通过细胞瞬时表达HA蛋白和间接免疫荧光实验发现,这4株单抗均可以与HA的HA1区域结合,不与HA2反应。以上结果表明,筛选获得的4株单抗均可识别H9N2 AIV HA1上相对保守的氨基酸序列,对H9N2 AIV具有广谱的血凝抑制活性,将为H9N2 AIV通用疫苗研制及高通量抗体检测方法的建立提供重要材料。

新型抗原亚群H9病毒的血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)抗原变异迅速,相继于2009年及2013年分别出现新的抗原亚群病毒,对该病毒的防控带来了极大的挑战。目前,关于H9N2禽流感病毒形成不同抗原亚群机制,尚不清楚。流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体是研究该机制的基础工具。为此,本研究通过血凝抑制(HI)实验筛选到1株新型的抗原亚群H9N2病毒H514。通过杂交瘤细胞融合技术以及间接免疫荧光的方法,筛选到5株抗H514病毒HA蛋白的单抗,均属于Ig G亚型。Western blot结果表明5株单克隆抗体中只有5E9作用的是线性表位,其余4株皆是针对构象表位。进一步地研究发现,这5株单克隆抗体对H514株皆有HI活性,最高达到2~8。这些结果为H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分子研究提供了重要材料。

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。

成都市2021年秋季重组禽流感(H5+H7) 三价灭活苗免疫抗体水平的监测与分析

为监测成都市重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗(H5N2 rSD57株+rFJ56株,H7N9 rLN79株)的免疫抗体水平,从成都市15个区(市)县的部分规模化养殖场、散养户中采集禽血清样本1320份,利用血凝和血凝抑制(HA-HI)试验监测H5和H7亚型禽流感的免疫抗体水平。结果得出:2021年秋季成都地区15个区(市)县禽流感的免疫抗体合格率为93.9%~99.8%;规模场H5亚型禽流感(rFJ56株、rSD57株)、H7亚型禽流感(rLN79株)的免疫抗体合格率分别为93.6%(674/720)、99.0%(713/720)、99.7%(718/720),散养户免疫抗体合格率分别为94.3%(566/600)、98.2%(589/600)、100.0%(600/600),各区(市)县之间免疫抗体合格率差异较小。本研究结果表明,重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗能够使禽群产生有效的抗体水平,该结果为做好H5、H7亚型高致病性禽流感的预防与控制工作提供了参考。

抗体选择压可导致H9N2 AIV NA基因发生变异

山东农业大学崔治中等研究了抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒（H9N2AIV）NA基因的变异情况。试验将LG1株H9N2AIV在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后，有3个系列从10-20代起在M基因的≠≠99位发生了可稳定遗传的碱基“G”到“A”的突变，

禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析

以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原，免疫BALB／c小鼠，细胞融合后，经间接ELISA和血凝抑制试验（HI）筛选，获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明，8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达113．2×10^3～1：5．1×10^4，其中2株HI效价达2^12。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝，与减蛋综合征（EDS-76）病毒、传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）均不反应。亚类鉴定证实，除1C7单抗为IgG2b外，其他7株均为IgG1亚类。Western blotting试验分析初步表明。8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原，其中3株针对核蛋白（NP）．2株针对基质蛋白M1，2株针对血凝紊HA／HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致，其中1株朱明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

以H9N2亚型禽流感病毒(AIV)为研究对象,将病毒灭活纯化后免疫羊驼,测得其血清抗体效价为1∶128000;提取羊驼外周血淋巴细胞RNA,获得单个重链可变区(VHH)基因,成功构建H9N2亚型AIV的纳米抗体噬菌体展示文库,文库库容量为1.3×10^(9)cfu/mL,阳性率为100%;以H9N2亚型AIV-NP蛋白为靶向抗原,利用噬菌体展示技术进行筛选,获得3株靶向H9N2亚型AIV-NP蛋白的纳米抗体;构建纳米抗体真核表达重组质粒,表达纯化后收获3株纳米抗体;通过间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光试验对纳米抗体的亲和力、特异性等生物活性进行鉴定,最终得到1株广谱性高亲和力的H9N2亚型AIV-NP蛋白纳米抗体,可为检测方法的建立提供新的生物材料。

三源重组H9N2禽流感病毒血凝素蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定

目的表达一株华南地区新发的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR技术扩增华南地区分离的H9N2亚型AIV HA基因,并克隆至pET-32a载体。将重组pET-32a-HA质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定HA蛋白的表达,并优化诱导表达的IPTG浓度、时间及温度,提高表达效率。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过Western blot、间接免疫荧光和ELISA检测多克隆抗体的特异性和效价,采用HI试验测定其血凝抑制效价。结果PCR扩增出HA基因,大小约为1700 bp。双酶切及测序结果表明,成功构建pET-32a-HA表达载体。经SDS-PAGE及Western blot验证该蛋白分子质量约79 ku,与预期一致,成功表达HA基因。对诱导条件进行优化,HA蛋白在28℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L诱导5 h表达量最高。制备的多克隆抗体可与HA蛋白特异性结合,其血凝抑制效价为1∶128,间接ELISA效价为1∶1638400。结论表达的pET-32a-HA蛋白具有免疫原性,制备的HA多克隆抗体具有良好特异性,且效价高,为建立ELISA检测方法及疫苗的研制奠定了基础。