广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

长臂猿感染H9N2亚型禽流感病毒病例报告

2022年1月,某动物园同一馆舍内饲养的6只长臂猿(Nomascus spp.)先后出现流清涕、咳嗽的症状。采集患病长臂猿鼻拭子共6份,利用高通量测序法对样本进行病原筛查,结果显示:2份样本呈AIV阳性,序列组装结果与H9N2亚型禽流感病毒的相似性最高;采用qPCR法对2份阳性样本进行H1~H16基因和N1~N9基因检测验证,发现5号样本H9 Ct值为31.35、N2 Ct值为36.16,6号样本H9 Ct值为27.46、N2 Ct值为29.57,均为阳性。给予患病长臂猿化痰止咳、消炎和控制继发感染等综合治疗,同时加强饲养环境消毒,患病长臂猿很快康复。

H9N2亚型禽流感病毒流行特征及疫苗研究进展

H9N2是一种对全球家禽业造成重要影响的低致病性禽流感病毒,1994年至今,其作为一种人畜共患病原体在我国持续流行变异,对家禽产业和人类生命健康构成严重危害。尤其是H9N2病毒与其他流感病毒间发生的基因重排或重组事件,使禽流感病毒可能跨越物种屏障感染人类和其他哺乳动物,给全球公共卫生带来新的威胁。因此,本文对H9N2的流行特征及其疫苗研发进展进行综述,希望对保护禽类产业经济健康和全球公共卫生安全提供参考。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

2株H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为深入了解禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)分子生物学特征,试验对河南省某发病蛋鸡场疑似AIV感染的病鸡组织进行病原分离,并对分离病原进行全基因组测序以及遗传进化和序列分析。结果显示:共分离2株H9N2亚型AIV,分别为A/chicken/Henan/HN22/2022(H9N2)和A/chicken/Shangqiu/01/2021(H9N2);2株分离株HA基因均位于h9.4.2.5谱系的分支2,内部基因与来自不同宿主的H7N9、H3N8等亚型AIV具有高度同源性且亲缘关系较近;2株分离株的HA蛋白裂解位点是PSRSSR,与低致病性AIV特性一致,其受体结合位点左侧臂发生Q234L突变,NA蛋白颈部第62~64位存在氨基酸缺失;接种2株分离株的试验鸡没有出现明显临床症状,没有导致气管和肺脏出血,与该亚型其他分离株不同。研究表明,试验分离的2株H9N2亚型AIV关键位点突变情况相对稳定,但仍有一些适应性突变产生,可能出现多种亚型同时感染鸡的情况。

H9N2亚型禽流感病毒跨种间感染传播的风险分析

为深入了解H9N2亚型禽流感病毒的生物学特征,研究对1998年H9N2亚型禽流感病毒流行以来GenBank和GISAID中公开的哺乳动物感染数据进行归纳,对H9N2亚型禽流感病毒的感染和分布情况进行分析。结果显示:中国报告的H9N2亚型禽流感病毒感染人的病例数据最多,占87.21%,且呈增加趋势。中国的75例病例中,以湖北省报告的最多。非人类哺乳动物感染病例涉及10种哺乳动物,包括猪、水貂、貉、雪貂、犬、果子狸、蝙蝠、猫、马和鼠兔,均为陆生哺乳动物,其中有61.4%的感染病例属于猪源。数据库中的大多数H9N2亚型禽流感病毒均含有关键氨基酸位点突变。研究表明,H9N2亚型禽流感病毒跨种间感染传播的风险高,关键氨基酸位点易发生突变,监测H9N2亚型禽流感病毒在哺乳动物中的感染分布至关重要。

影响H9N2亚型禽流感病毒生物学特性的关键氨基酸位点分析

H9N2亚型禽流感病毒是在我国家禽中流行最为广泛的亚型,严重影响养禽业健康发展,具有感染哺乳动物的能力。可感染人类的H5N1、H7N9、H10N8和H3N8等新型流感病毒中多次发现H9N2亚型禽流感病毒的内部基因,而这些感染人类的新型流感病毒对公共卫生安全造成了巨大威胁。文章围绕H9N2亚型禽流感病毒,总结了影响该亚型病毒致病性、受体结合、复制能力以及在家禽或哺乳动物中与传播有关的关键功能氨基酸位点突变的研究进展,以期进一步解析H9N2亚型禽流感病毒及其内部基因在新型流感病毒产生过程中的机制和作用。

天蚕素对H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒和禽致病性大肠杆菌共感染肉鸡的干预作用

试验旨在探讨天蚕素对H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒(AIV)与禽致病性大肠杆菌(APEC)共感染致炎性渗出的干预效果,为临床H_(9)N_(2)亚型AIV与APEC共感染的有效防治提供参考。试验选取150只14日龄白羽肉鸡,随机分为5组,每组3个重复,每个重复10只鸡。对照组肉鸡使用无菌生理盐水0.2 mL滴鼻,APEC感染组肉鸡使用含2.09×109 CFU APEC O2菌株肉汤0.2 mL滴鼻,H_(9)N_(2)感染组肉鸡使用H_(9)N_(2)病毒尿囊液(约105 EID50 H_(9)N_(2)病毒)0.2 mL滴鼻,H_(9)N_(2)+APEC感染组肉鸡使用0.2 mL APEC O2菌株肉汤离心后的沉淀与0.2 mL H_(9)N_(2)病毒尿囊液混匀得到的病毒尿囊液滴鼻,H_(9)N_(2)+APEC干预组肉鸡采用与H_(9)N_(2)+APEC感染组相同处理后,使用天蚕素饮水(300 mg/kg)+基础饲粮饲喂,其余各组正常饮水+基础饲粮饲喂。正式试验期21 d。结果显示,H_(9)N_(2)+APEC感染组肉鸡临床症状极为明显,死亡率显著升高(P<0.05),气管和肺脏病变最为严重。与H_(9)N_(2)+APEC感染组相比,H_(9)N_(2)感染组和APEC感染组在感染后第3、7、14、21 d时的H_(9)N_(2)病毒拷贝数和APEC载量均显著降低(P<0.05);H_(9)N_(2)+APEC干预组在感染后第3、7、14、21 d时的H_(9)N_(2)病毒拷贝数均显著降低(P<0.05),H_(9)N_(2)+APEC干预组在感染后第7、14、21 d时的APEC载量均显著降低(P<0.05)。研究表明,天蚕素可以缓解H_(9)N_(2)亚型AIV、APEC以及两者共感染引起的肉鸡呼吸道症状,降低死亡率,其机制与天蚕素降低病原在组织内的载量及修复呼吸系统、改善呼吸机能有关。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

2023年江苏常州地区H9N2亚型禽流感病毒遗传演化与抗原性分析

试验旨在调查H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月,在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展H9N2亚型AIV流行病学调查,试验采集鸡、鸭、鹅、鸽等咽拭子、组织样品以及环境拭子共计1970份,进行AIV分离及其流行病学特征分析,并对分离的H9N2亚型AIV进行遗传演化、关键氨基酸与糖基化位点和抗原性分析。结果显示:共鉴定出73株H9N2亚型AIV,平均分离率为3.70%;4月和5月分离率较高,分别为7.07%和8.00%;分离地点中活禽市场和交易平台的分离率最高;H9N2亚型AIV在鸡、鸭、鸽、野鸟粪便和环境中均有分离,在环境和鸡中的分离率最高,分别为6.90%和4.15%;分离的H9N2亚型AIV属于欧亚谱系9.1分支中Group2群,与2021—2023年多个地区人感染H9N2亚型AIV亲缘关系较近;与参考株序列相比,H9N2亚型AIV分离株HA蛋白的130-loop、150-loop及190-helix存在明显氨基酸多态性,但没有发现新的糖基化位点;H9N2亚型AIV分离株均属于当前优势流行的抗原群,尚未发生明显抗原漂移。综上所述,江苏常州地区H9N2亚型AIV流行的热点场所是活禽市场和交易平台,提示环境消毒是控制病毒传播和污染的关键手段;H9N2亚型AIV可能在野生禽类中流行,须减少家禽与野禽接触;并且H9N2亚型AIV分离株HA蛋白受体结构域变异可能对人间感染造成持续威胁,值得关注。

2株2023年禽源H7N9亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的遗传进化特点,探究我国H7N9亚型AIV的流行特征,试验对2023年采集自四川、河北两地活禽市场禽类咽拭子及泄殖腔拭子进行病原分离鉴定,并对分离株进行全基因组序列测定,进一步构建进化树并分析其遗传演化情况和分子特征。结果显示:共分离2株H7N9亚型AIV,其遗传距离较近,HA基因均属于YRD-B分支;2株AIV的HA蛋白裂解位点均含有连续碱性氨基酸,具有高致病性的分子特征;PB2、HA和NA蛋白均具有哺乳动物适应性突变,其中HA蛋白第226位受体结合位点均由谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L),使其能够识别人流感病毒唾液酸受体,并且HA蛋白A27S、I96V、V143T、A169T、I187V和D457N抗原位点发生突变;2株AIV虽均能与Re-4和H7N9rHN7903灭活疫苗免疫血清产生交叉血凝抑制反应,但HI抗体效价较低。研究表明,从活禽市场分离到2株H7N9亚型AIV,其对家禽具有高致病性,且抗原性发生变化。

6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。

H9N2亚型禽流感病毒PB2蛋白哺乳动物适应性变异的筛选与功能鉴定

研究旨在鉴定H9N2亚型禽流感病毒PB2基因进化产生的哺乳动物适应性突变并明确其在哺乳动物宿主中的复制能力和致病性。试验通过建立中国源H9N2亚型禽流感病毒PB2氨基酸序列库、利用多态性分析以及聚合酶活性检测,筛选出PB2基因演化出的潜在适应性位点,并进一步利用哺乳动物细胞以及小鼠模型明确新突变的哺乳动物适应性。结果显示:PB2氨基酸序列中存在12个具有明显多态性的位点,其中PB2-340K、PB2-588V以及PB2-627V的变化趋势与自2015年起人感染病例增加呈正相关,并表现明显的人宿主偏好;这3个突变中,PB2-E627V显著增强了H9N2亚型禽流感病毒在人源293T细胞中聚合酶活性,并且显著提高了H9N2亚型禽流感病毒在哺乳动物细胞中的复制能力以及在小鼠中的病毒载量和致病性。以上研究表明,H9N2亚型禽流感病毒PB2蛋白表现出哺乳动物适应性进化特点,并且能够增强对小鼠的致病性,带来跨宿主感染风险。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。

H9N2亚型禽流感病毒感染鸡呼吸道应答模式研究

【目的】通过建立H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染鸡上呼吸道炎症模型,探索其感染鸡上呼吸道引起的炎症反应。【方法】将H9N2亚型AIV流行毒株GD10142,按照100μL/只(108 EID 50/100μL)的剂量通过滴鼻点眼方法感染SPF鸡,并在感染后观察鸡的临床特征,采集感染后0、1、3、5、7、9 d的咽拭子和血清样品;感染后5和9 d剖检观察鸡的呼吸道和肺脏病理变化,收集气管灌洗液、气管和肺脏组织;通过实时荧光定量PCR检测咽拭子、气管灌洗液、气管和肺脏组织中的病毒载量;应用ELISA方法检测感染后血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG的变化规律,通过血清中和试验分析血清中和抗体的活性;通过ELISA方法检测血清和气管灌洗液中炎症相关细胞因子白细胞介素6(IL-6)、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子κB(NF-κB)的水平。【结果】H9N2亚型AIV感染后鸡没有出现典型的临床特征,但感染后1~5 d在咽拭子中可检测到病毒核酸,且感染3 d后病毒载量最高,感染5 d后检测不到病毒核酸;感染5 d时,在气管灌洗液、气管和肺脏检测到病毒核酸,其中前两者载量高于肺脏;血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG在感染后3 d增多,感染后5~9 d维持较高水平,且具有较强的病毒中和活性;血清IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB也在感染后3 d开始呈上升趋势;但气管灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB含量很低,且感染前后无明显变化。【结论】本研究成功建立了H9N2亚型AIV感染鸡呼吸道模型,确定上呼吸道是H9N2亚型AIV主要感染和增殖部位,H9N2亚型AIV感染诱导机体产生促炎和抑炎细胞因子,可能是感染动物维持免疫稳态的重要因素。本研究为深入探索H9N2亚型AIV的致病机制和宿主防御机制奠定了基础。

M1基因模式差异对H9N2亚型禽流感病毒增殖特性的影响

为探究基质蛋白1(M1)对H9N2亚型禽流感病毒适应性的影响,研究基于M1的5种主要模式,利用反向遗传技术拯救了5株具有不同M1基因模式的H9N2亚型禽流感病毒,通过测定病毒的一步与多步生长曲线以及生长竞争优势试验探讨M1对H9N2亚型禽流感病毒增殖能力的影响,将MOI均为0.001的5株病毒共感染MDCK细胞,感染后48h提取细胞上清的病毒RNA,将反转录的cDNA样品进行单核苷酸多态性(SNP)测序。结果显示:M1为P5模式的H9N2亚型禽流感病毒增殖能力显著高于其余4株病毒(P<0.05),P5模式病毒的M1基因所涉及的9个可检测的氨基酸位点占比超过74%。研究表明,M1为P5模式的H9N2亚型禽流感病毒具有最强的增殖能力和明显的生长竞争优势,结果从M1对病毒增殖能力影响角度解释了该分支病毒在我国禽群中广泛流行的原因。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒的构建

为构建H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒,以血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neurami-nidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种蛋白为对象,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2种重组杆状病毒,即rBV-HA-M1和rBV-NA,用IFA和Western-blot鉴定重组蛋白的免疫活性,再将rBV-HA-M1和rBV-NA以最佳感染复数比例共感染昆虫Sf9细胞,经浓缩后获得病毒样颗粒,同时进行血凝滴度测定和透射电镜观察。透射电镜观察结果显示,表达的HA-M1和NA重组蛋白可以在Sf9细胞中自组装形成病毒样颗粒,浓缩的病毒样颗粒能够凝集1%的鸡红细胞,血凝效价为1∶64。试验结果为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒疫苗奠定了基础。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。