禽流感H7N9亚型病毒样颗粒疫苗的制备与免疫效果评估

为了获得能代替商品化灭活苗的禽流感H7N9亚单位疫苗,试验将H7N9亚型禽流感病毒的HA基因跨膜区进行点突变,构建同时表达HA、NA和M1基因的供体质粒;然后将供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒(Bacmid);将鉴定正确的重组Bacmid转染Sf9细胞,对重组杆状病毒表达的蛋白进行血凝试验、Western-blot、SDS-PAGE、透射电镜、免疫原性等一系列评价。结果表明:重组杆状病毒表达的蛋白液HA效价可达1∶2048;Western-blot显示出现3条特异性条带;透射电镜可见与禽流感病毒结构类似的颗粒物;表达的病毒样颗粒(VLPs)蛋白制备成疫苗,HI效价略高于商品化疫苗。说明3种蛋白能自我组装成VLPs,该VLPs疫苗具有良好的免疫原性。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

影响H9N2亚型禽流感病毒生物学特性的关键氨基酸位点分析

H9N2亚型禽流感病毒是在我国家禽中流行最为广泛的亚型,严重影响养禽业健康发展,具有感染哺乳动物的能力。可感染人类的H5N1、H7N9、H10N8和H3N8等新型流感病毒中多次发现H9N2亚型禽流感病毒的内部基因,而这些感染人类的新型流感病毒对公共卫生安全造成了巨大威胁。文章围绕H9N2亚型禽流感病毒,总结了影响该亚型病毒致病性、受体结合、复制能力以及在家禽或哺乳动物中与传播有关的关键功能氨基酸位点突变的研究进展,以期进一步解析H9N2亚型禽流感病毒及其内部基因在新型流感病毒产生过程中的机制和作用。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。

同时鉴别诊断H7亚型和5种NA亚型禽流感病毒GeXP检测方法的建立

目的旨在建立同时鉴别诊断H7亚型及其5种NA亚型(N2、N3、N4、N7和N9)AIV的检测方法。方法针对H7亚型HA基因、5种NA亚型NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计了6对亚型特异性引物和1对AIV亚型通用检测引物,利用GeXP多基因表达和毛细管电泳分析技术,建立同时检测H7亚型和5种NA亚型AIV的GeXP高通量分型鉴别诊断方法,对其进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果特异性结果显示该法单管可同时检测H7、N2、N3、N4、N7和N9亚型AIV,均能检出对应的亚型AIV,通用检测引物检出所有亚型AIV,与其它常见禽病病原体不存在交叉反应。敏感性结果显示该法对7种AIV目的基因(含H7、N2、N3、N4、N7、N9基因)浓度均为100拷贝/μL时,仍可同时检测出。该法对150份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定一致。结论本研究建立的同时鉴别诊断H7亚型和5种亚型AIV GeXP高通量检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和简便等优点,为防控AIV提供新型检测方法。

2014-2018年新疆人感染H7N9禽流感分子流行病学特征分析

目的分析2014-2018年新疆14例人感染H7N9禽流感病例的分子流行病学特征,为防控及治疗提供科学依据。方法提取核酸后采用高通量基因测序技术获得基因组序列,并用生物信息学分析软件对基因组序列进行同源性分析、进化分析、变异位点分析及同源建模。结果14例人感染H7N9禽流感病毒HA基因核苷酸同源性介于97.39%~100%,氨基酸同源性介于98.38%~100%;NA基因核苷酸同源性介于97.73%~100%,氨基酸同源性介于97.73%~100%,均属于长江三角洲谱系和低致病性禽流感病毒,分属于2个亚分支,与A/Hunan/02650/2016疫苗株最为接近。HA蛋白G186V、T160A全部发生了变异,Q226L中13株病毒发生了变异,NA蛋白4个关键的神经氨酸酶抑制剂耐药位点全部未发生变异。M2蛋白S31N和V27A位点全部发生了突变,PB1蛋白T368V位点全部发生了突变,PA蛋白位点K356R全部发生了突变。结论新疆H7N9禽流感病毒具有双受体结合性,对金刚烷胺类药物耐药,对神经氨酸酶抑制剂敏感,可在疾病发生早期及时使用神经氨酸酶抑制剂。需加强禽流感病毒基因组变化的监测,做好基因突变的应对措施。

H9N2亚型禽流感病毒感染鸡呼吸道应答模式研究

【目的】通过建立H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染鸡上呼吸道炎症模型,探索其感染鸡上呼吸道引起的炎症反应。【方法】将H9N2亚型AIV流行毒株GD10142,按照100μL/只(108 EID 50/100μL)的剂量通过滴鼻点眼方法感染SPF鸡,并在感染后观察鸡的临床特征,采集感染后0、1、3、5、7、9 d的咽拭子和血清样品;感染后5和9 d剖检观察鸡的呼吸道和肺脏病理变化,收集气管灌洗液、气管和肺脏组织;通过实时荧光定量PCR检测咽拭子、气管灌洗液、气管和肺脏组织中的病毒载量;应用ELISA方法检测感染后血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG的变化规律,通过血清中和试验分析血清中和抗体的活性;通过ELISA方法检测血清和气管灌洗液中炎症相关细胞因子白细胞介素6(IL-6)、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子κB(NF-κB)的水平。【结果】H9N2亚型AIV感染后鸡没有出现典型的临床特征,但感染后1~5 d在咽拭子中可检测到病毒核酸,且感染3 d后病毒载量最高,感染5 d后检测不到病毒核酸;感染5 d时,在气管灌洗液、气管和肺脏检测到病毒核酸,其中前两者载量高于肺脏;血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG在感染后3 d增多,感染后5~9 d维持较高水平,且具有较强的病毒中和活性;血清IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB也在感染后3 d开始呈上升趋势;但气管灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB含量很低,且感染前后无明显变化。【结论】本研究成功建立了H9N2亚型AIV感染鸡呼吸道模型,确定上呼吸道是H9N2亚型AIV主要感染和增殖部位,H9N2亚型AIV感染诱导机体产生促炎和抑炎细胞因子,可能是感染动物维持免疫稳态的重要因素。本研究为深入探索H9N2亚型AIV的致病机制和宿主防御机制奠定了基础。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

抗H7N9流感病毒的单克隆抗体与胃组织的交叉反应研究

目的筛选鉴定与胃组织交叉反应的抗H7N9流感病毒的单克隆抗体,初步探讨流感病毒感染会引发肠道相关疾病的可能致病机制。方法利用H7N9流感病毒制备了大量的单克隆抗体,对制备的单克隆抗体运用ELISA方法进行亚型和效价测定,免疫组化对制备的单克隆抗体与组织的反应性进行筛选,巢式PCR分子生物学技术克隆单克隆抗体轻重链可变区序列。结果制备的单克隆抗体H7N9-71和H7N9-78均能与H7N9抗原特异性结合,抗体效价达1∶10~5,免疫组化结果表明H7N9-71、H7N9-78与人的胃组织能发生特异性反应,进一步的研究发现这两株单抗与小鼠胃组织能特异性结合。轻重链可变区序列结果证实二者为两株不同的单抗。结论H7N9流感病毒可能与胃组织之间存在异嗜性抗原,提示流感病毒感染可能与胃肠道疾病的发生存在某些关联。

H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒的构建

为构建H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒,以血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neurami-nidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种蛋白为对象,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2种重组杆状病毒,即rBV-HA-M1和rBV-NA,用IFA和Western-blot鉴定重组蛋白的免疫活性,再将rBV-HA-M1和rBV-NA以最佳感染复数比例共感染昆虫Sf9细胞,经浓缩后获得病毒样颗粒,同时进行血凝滴度测定和透射电镜观察。透射电镜观察结果显示,表达的HA-M1和NA重组蛋白可以在Sf9细胞中自组装形成病毒样颗粒,浓缩的病毒样颗粒能够凝集1%的鸡红细胞,血凝效价为1∶64。试验结果为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒疫苗奠定了基础。

灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

16株新型H3N3亚型禽流感病毒的遗传变异分析

为了解新出现的H3N3亚型禽流感病毒(AIV)的遗传变异特征,对2022—2023年分离鉴定的H3亚型AIV进行了全基因组测序分析,并对代表株进行了抗原差异分析。结果共分离鉴定出15株家禽源和1株野鸟源H3N3亚型AIV。全基因遗传演化分析结果显示,16株分离株均属于欧亚分支,其HA基因均源自H3N8亚型AIV,与人源H3N8亚型AIV的核苷酸相似性为97.3%~99.2%;NA基因均源自H10N3亚型AIV,与人源H10N3亚型毒株的核苷酸相似性为98.1%~98.4%;内部基因片段均来自H9N2亚型AIV。分离株HA基因裂解位点均符合低致病性AIV的分子特征。分离毒株存在多个能增强病毒对哺乳动物适应性及致病性的突变位点,如PB2蛋白的A588V和E627V突变、PB1蛋白的I368V和S375N突变等。抗原差异性分析结果表明,分离株与华东地区早期流行株的HI抗体滴度相差1 log2~3 log2。因此,本研究分离的16株H3N3亚型AIV均为三源重组病毒,由H9N2亚型AIV提供全部内部基因,毒株存在多个哺乳动物适应性及致病性增强的突变,并已传播给野禽。本研究揭示了新型H3N3亚型AIV的遗传特征、变异和多宿主分布情况,为禽流感的防控提供理论支持。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

中国H7N9禽流感遗传演化趋势及防控措施

H7N9禽流感病毒(AIV)感染人类的情况最先出现在中国,而且具有很高的突变性。2013年首次在人类身上分离出的是低致病性H7N9禽流感病毒,发展到2017年,已经出现高致病性H7N9禽流感病毒,严重威胁动物和人类的生命健康安全,同时,还会对社会的稳定和经济发展有一定的影响。综述通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)和GISAID数据库收集了中国国内2001~2021年共4641条有关H7N9的数据,拟通过流行病学的角度来说明H7N9禽流感病毒在中国的发生、发展以及在时间、空间和种群间的分布情况,同时总结中国对H7N9所引起的大流行所采取的防控措施,以期为后续的疫情防控措施规划提供依据。

神经介素B及受体NMBR和PD-L1在H9N2亚型流感病毒感染过程中的相互作用研究

神经介素B(NMB)及其G蛋白偶联受体(NMBR)发挥的抗甲型流感病毒免疫反应,以及甲型流感病毒感染诱导细胞程序性死亡配体1(PD-L1)高表达均与NF-κB信号通路有直接关系,而NF-κB信号通路的激活受ERK信号通路的调控。为深入探究NMB与NMBR调节H9N2亚型流感病毒感染诱导PD-L1上的作用,本研究以H9N2亚型流感病毒为模式毒株,基于NMBR干扰和过表达细胞系、PD-L1干扰和过表达细胞系以及C57BL/6小鼠,采用RT-PCR和Western blot方法分析NMB与NMBR对PD-L1表达变化以及ERK磷酸化的影响。结果显示:H9N2亚型流感病毒感染诱导的NMBR和PD-L1表达之间存在着负调控的关系,外源性NMB可以有效激活小鼠体内NMBR的表达,进而抑制PD-L1表达,NMB与NMBR也能影响H9N2感染诱导的ERK磷酸化水平。综上,H9N2亚型流感病毒感染诱导表达的NMB与NMBR通过ERK信号通路调节PD-L1的表达而发挥抗流感病毒作用,将为深度剖析宿主-甲型流感病毒之间的互作关系提供新的科学依据。

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV(简称H7N9 AIV)mRNA疫苗,本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR),构建了中间转录质粒pGEM-YN和pXT7-YN,以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA mH7-YN-pGEM和mH7-YN-pXT7;将2种mRNA转染HEK293T细胞,western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带;通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达,结果显示,3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强;将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明,本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的mRNA,且其均能够在HEK293T细胞和CEF中正确表达HA蛋白,3μg mRNA转染HEK293T细胞可获得最佳的蛋白表达水平,转染24 h后HA蛋白的表达水平达到最高。本研究基于UTR序列的差异首次正确构建了两种能在哺乳动物细胞和禽类细胞中高效表达H7N9 AIV HA蛋白的mRNA,为禽流感mRNA疫苗的研发和免疫效力评估奠定了良好的物质和技术基础。