用于禽流感H9亚型检测的压电免疫蛋白芯片的研制

目的：研制禽流感H7亚型检测的压电免疫蛋白芯片。方法：采用聚乙烯亚胺（PEI）粘附、戊二醛（Glu）交联的方法，将禽流感H9抗原固定于石英晶体的金电极表面。研究了敏感材料的浓度、pH值对其固定的影响。结果：该芯片用于检测浓度范围为0．123～1．23mg／ml的禽流感H9血清时，呈线性相关，相关系数0．9854。结论：检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比大于2，可用于定性定量检测。

种鸡开产前免疫不同新城疫-传染性支气管炎-禽流感H9三联油苗的效果观察

为了探讨尽可能延长母鸡开产后免疫保护期的可能性,本试验选用市售的两种新城疫(ND)-传染性支气管炎(IB)-禽流感(AI)H9三联灭活商品疫苗在广西地区主要地方品种三黄鸡的两个品系黄1和黄2上分别进行对比免疫试验。种鸡开产前的150日龄分别使用疫苗A(精制浓缩型油苗)、疫苗B(普通油苗)免疫,然后分别于免疫时以及免疫后的1个月、2个月、3个月、4个月和5个月分别使用HI试验和ELISA测定两组鸡只相应产生的血清抗体滴度。结果表明,在黄1品种上的试验,疫苗A免疫组的ND抗体水平高于疫苗B免疫组,两组鸡的H9、IB抗体水平则无明显差异;在黄2品种的试验,疫苗A免疫组的ND、H9、IB抗体水平均高于疫苗B免疫组;开产前免疫疫苗A后5个月,黄1和黄2品种均仍能维持较高的抗体水平,其中黄1品种可推迟补免时间20多天,黄2品种推迟补免时间1个月。

低致病性禽流感H9N2感染蛋鸡引发肠毒综合征诊治

蛋鸡养殖场的鸡肠毒综合征是由低致病性禽流感(H9N2)感染引起,虽不会一次性造成家禽大批死亡,也会给养禽业造成严重的经济损失。试验表明,通过科学合理的治疗措施,疗效显著。

禽流感H9亚型流行毒株交叉免疫保护试验

采用北京市农林科学院畜牧兽医研究所1998年-2008年在北京及河北省分离的4株禽流感病毒H9亚型流行毒株,分别制备不同分离毒株灭活疫苗,免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果表明,用4个不同时期的分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,各免疫组鸡禽流感(H9亚型)的HI抗体效价均明显上升,所诱导产生的HI抗体效价基本相同;不同时期分离毒株大多产生了较好的交叉保护力。用1998年、2004年及2006年分离的流行毒株制备出的灭活疫苗能够保护2008年流行毒株的攻击。

石家庄地区蛋鸡新城疫、禽流感H9抗体检测及免疫程序初探

为了掌握蛋雏鸡和青年鸡的新城疫(ND)和禽流感H9抗体消长规律,形成雏鸡、青年鸡推荐免疫程序,在1、3、6、10、14、20、28、42、54、65、94、114日龄随机抽取24只鸡采血进行抗体监测。结果可知雏鸡1～6日龄ND抗体水平先升高再降低,6日龄即达到7log2;7日龄免疫后没有产生足够的抗体,至20日龄达到4log2;20日龄免疫后ND抗体在一直上升,至54日龄开始下降,此后开始上升,但至114日龄抗体又开始下降;禽流感H9抗体在7日龄、20日龄免疫后,直至42日龄后才上升,并于55日龄第三次免疫后高于10log2,此后至114日龄一直高于10log2。综上,根据本试验结果制定了适合石家庄地区的免疫程序。

禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的研制和初步应用

目的:获得特异针对禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体。方法:以H9N2亚型病毒制成疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,取细胞上清用HI筛选。结果:共获得9株稳定分泌针对血凝素蛋白抗体的杂交瘤细胞;经广谱性和特异性鉴定,所有单抗株均能与所有检测的82株不同年代不同地方不同禽源H9亚型流感病毒大部分分离株反应,且所有单抗株均不与非AⅣ-H9病毒反应,而其中一株(8E6)能与所有检测的H9亚型病毒株反应。进行Western blot分析显示, 其中8株单抗能与AⅣ的Mr为75 000处反应,表明是针对AⅣ H9 HA的单抗。结论:本试验获得9株广谱性特异性很好的单抗,特别是8E6株;这些单抗株为以后作病毒抗原性位点分析、临床检测和流行病学调查提供了良好试剂。

他留乌骨鸡保种场新城疫、禽流感H9抗体检测及免疫程序探讨

为掌握他留乌骨鸡保种场现行免疫程序下鸡新城疫和禽流感H9抗体消长规律,在刚出壳的雏鸡中随机选择200羽单独饲养,在1、5、10、15、21、28、35、42、56、64、91、120、180日龄随机抽取32羽从翅静脉采血,分离血清后冷冻,采用血凝(HA)与血凝抑制试验(HI)分别开展新城疫抗体检测和高致病性禽流感H9抗体检测。结果:雏鸡1~7日龄鸡新城疫抗体水平较高,此后至21日龄鸡新城疫抗体均为下降趋势,禽流感H9抗体1~15日龄较高,此后到35日龄一直处于下降阶段,50日龄免疫后持续升高,180日龄时保持在7.57log2。根据本次检测结果调整制定了适合他留乌骨鸡保种场使用的免疫程序。

用禽流感H9SD株适时强免对提高蛋鸡生产性能的影响

为了防控低致病性禽流感引发的产蛋下降症,在用禽流感H9HL株免疫(对照组)的同时,再用H9SD696株强化免疫2次(试验组)。结果显示,不同时期抗体效价试验组比对照组平均高出0.66个滴度;平均周产蛋率高出1.25%;死淘率降低2.78%,生产性能和经济效益显著提高。用不同毒株的疫苗免疫鸡群在防控低致病性禽流感的实践中能发挥协同防患的作用,具有一定推广价值。

蛋鸡产蛋期感染低致病性禽流感H9诊断及治疗措施

近些年,我国较多区域中都出现了传染性疾病,尤其是养鸡场,低致病性禽流感H9体现出呼吸道症状,患病鸡有食欲降低和饮水量降低的症状,还会降低蛋鸡产蛋量。低致病性禽流感H9的出现,更多和感染大肠杆菌存在关系,增加患病鸡死亡率,也增加了患病鸡的病情控制难度。

禽流感H9灭活疫苗免疫蛋鸡试验研究

为了研究禽流感H9油乳剂灭活疫苗对蛋鸡的免疫效果,从而更好地预防禽流感,本试验对接种2次禽流感H9油乳剂灭活疫苗鸡群与未接种疫苗的鸡群进行抗体效价对比,结果显示接种2次的鸡群高抗体的水平可持续多天,未接种的鸡群抗体效价上升和下降的幅度不大,甚至到后期趋于下降。因此禽流感H9油乳剂灭活疫苗对预防蛋鸡禽流感有显著效果。

禽流感H9非免疫鸡场与免疫鸡场鸡群HI抗体的比较研究

为了解禽流感H9在非免疫鸡群的感染情况和免疫鸡场的免疫效果,本试验在四川分别选择一个非免疫鸡场和免疫鸡场,用微量HI试验对187份不同日龄的非免疫鸡血清(56、85、92、149、256、410日龄)和222份不同日龄的免疫鸡血清(53、87、145、264、398日龄)进行了抗体检测,结果显示:非免疫鸡群禽流感H9阳性率分别为34.38%、37.14%、29.41%、38.71%、46.67%、52.00%,免疫鸡群阳性率分别为76.27%、84.31%、88.37%、91.89%、81.25%。试验表明非免疫鸡群的禽流感H9感染较严重,免疫鸡群免疫后的效果较好。

广西首例人感染甲型禽流感H9N2病毒病例流行病学调查分析

目的对广西首例人感染甲型禽流感H9N2病毒病例的临床治疗和流行病学调查分析,为今后的科学防治提供依据。方法2021年12月11日对广西上林县某中学1名诊断为感染甲型禽流感H9N2病毒女学生的密切及次密切接触者和当地活禽市场进行流行病学调查,并采集样品共161份进行实验室检测。结果除该女学生检测确诊为甲型禽流感H9N2病毒感染者外,与患者密切和次密切接触者核酸检测均为阴性。但患者家庭住宅地鸡舍和当地活禽市场所采集的样品,经检测其禽类甲型流感病毒均为阳性。结论患者感染甲型禽流感H9N2病毒与当地禽类存在禽类甲型流感病毒密切相关。

禽流感H9N2病毒样颗粒疫苗佐剂的筛选及其对鸡的免疫效果评价

为使禽流感H9N2病毒样颗粒疫苗尽早投入市场,有效防控H9N2禽流感的流行,拟从油乳、ISA 206和微球佐剂中筛选出一种最适用于禽流感H9N2病毒样颗粒疫苗的佐剂。首先对H9N2病毒样颗粒血凝效价及血凝素(HA)含量的测定,然后制备出禽流感H9N2病毒样颗粒油乳疫苗、ISA 206佐剂疫苗、微球疫苗,并对其稳定性、无菌性和安全性等进行检验。通过溶菌酶含量、血凝抑制试验以及T淋巴细胞刺激指数等试验检测其非特异性免疫和特异性免疫水平。结果表明:微球VLP疫苗组溶菌酶含量高于其他各疫苗组(p﹤0.01),能引起非特异性免疫;微球VLPs(口服)疫苗组的血凝抑制滴度高于其他各疫苗组(p﹤0.01),抗体增长趋势与阳性对照组无显著差异(p>0.05),产生了有效的体液免疫应答;微球VLP疫苗(口服)疫苗组T淋巴细胞刺激指数最高。微球口服疫苗其免疫原性强,安全稳定,能诱导机体产生有效的免疫应答,可为新型病毒样颗粒疫苗佐剂的选择提供参考。

HVJ-E作为禽流感H9亚型灭活苗免疫佐剂的展望

近年来,禽流感已经成为各国动物疾病防控的重中之重,其中H9N2亚型虽然是一类低致病性禽流感病毒,但其感染范围广,发病迅速,可造成重大损失。现阶段,使用灭活苗是预防H9亚型禽流感的主要方法,虽然该类疫苗可以使免疫鸡在临床上不表现发病症状,但并不能阻止其感染后的排毒和对肌肉品质造成一定的影响。研究发现,HVJ-E具有双重免疫调节作用,有希望作为H9亚型灭活苗免疫佐剂应用于临床。

鸽场乳鸽禽流感H9母源抗体消长规律初探

禽流感可分为高致病性禽流感、低致病性禽流感,高致病禽流感以H5和H7亚型为代表,低致病性禽流感以H9亚型为代表[1]。H9亚型禽流感一般呈现较低的发病率和死亡率,但可引起禽呼吸道症状、造成料重比升高、产蛋下降等症状[2-3],H9亚型也有感染儿童的报道[4-5]。鸽子相对其他家禽来说具有较高的抗病能力,一般呈隐形感染不会造成死亡,但H9可与其他病原体协同作用,给养殖户带来巨大的经济损失[6]。因此,仍需养殖场高度重视,制定免疫程序进行疫苗免疫。本文对母鸽和乳鸽的H9亚型禽流感抗体水平进行监测,为制定适合本场的免疫程序提供科学依据。

灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗免疫效果研究

为探讨制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗(以下简称新支流滑四联灭活疫苗)免疫效果,试验采用新城疫病毒(NDV)La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞,用易感鸡胚增殖传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,H9亚型禽流感病毒(AIV)ML01株接种MDCK-sc悬浮细胞,用改良Frey氏培养基发酵培养鸡滑液囊支原体(MS)ML-MS1株,收获抗原液,制备新支流滑四联灭活疫苗,并对疫苗进行安全性和效力测定;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIV(H9亚型)HI抗体,并于免疫后21 d进行NDV和AIV攻毒;30日龄SPF鸡首免H120株,免疫后21 d采血测定IBV HI抗体效价,并以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量进行二免,免疫后7、14、21、28 d采血测定IBV HI抗体;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21、30 d采血测定MS ELISA抗体,并于免疫后30 d进行MS攻毒。结果显示:制备的新支流滑四联灭活疫苗安全性良好、效力合格;免疫后21 d NDV HI效价为6.6~8.8 log2,AIV HI效价为7.0~9.7 log2;免疫后28 d IBV HI效价为5.6~7.8 log2,且二免是首免的3.2~14.9倍;免疫后30 d MS ELISA效价为3 164~6 847;攻毒试验结果显示,0.05 mL/只剂量组对ML-MS1攻毒保护率为80%(8/10),其余组均为100%(10/10)保护。研究表明,新支流滑四联灭活疫苗对SPF鸡安全、有效,以0.1 mL/只剂量免疫SPF鸡可获得较好的免疫效果。

2023年江苏常州地区H9N2亚型禽流感病毒遗传演化与抗原性分析

试验旨在调查H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月,在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展H9N2亚型AIV流行病学调查,试验采集鸡、鸭、鹅、鸽等咽拭子、组织样品以及环境拭子共计1970份,进行AIV分离及其流行病学特征分析,并对分离的H9N2亚型AIV进行遗传演化、关键氨基酸与糖基化位点和抗原性分析。结果显示:共鉴定出73株H9N2亚型AIV,平均分离率为3.70%;4月和5月分离率较高,分别为7.07%和8.00%;分离地点中活禽市场和交易平台的分离率最高;H9N2亚型AIV在鸡、鸭、鸽、野鸟粪便和环境中均有分离,在环境和鸡中的分离率最高,分别为6.90%和4.15%;分离的H9N2亚型AIV属于欧亚谱系9.1分支中Group2群,与2021—2023年多个地区人感染H9N2亚型AIV亲缘关系较近;与参考株序列相比,H9N2亚型AIV分离株HA蛋白的130-loop、150-loop及190-helix存在明显氨基酸多态性,但没有发现新的糖基化位点;H9N2亚型AIV分离株均属于当前优势流行的抗原群,尚未发生明显抗原漂移。综上所述,江苏常州地区H9N2亚型AIV流行的热点场所是活禽市场和交易平台,提示环境消毒是控制病毒传播和污染的关键手段;H9N2亚型AIV可能在野生禽类中流行,须减少家禽与野禽接触;并且H9N2亚型AIV分离株HA蛋白受体结构域变异可能对人间感染造成持续威胁,值得关注。