禽源U6启动子介导鸡马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA的筛选及干扰活性鉴定

为筛选鸡马立克氏病病毒(MDV)gI、gE基因特异性siRNA,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因各5个靶位点的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,将制备的shRNA表达盒分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细胞,并根据荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果评价siRNA抑制融合荧光蛋白表达的效率。结果表明,gI和gE基因的抑制效率为10%～80%。分别将其中抑制效率最高的一条shRNA插入pGEM-T载体中构建重组表达质粒pcU6-shgI735和pcU6-shgE936,通过不同细胞系稳定干扰试验和抑制病毒复制试验评价其干扰活性。结果显示,pcU6-shgI735和pcU6-shgE936能够明显抑制融合蛋白的表达及MDV在CEF细胞中的增殖,并且禽源U6启动子构建的表达盒在禽源细胞(DF1)中的活性比在哺乳动物细胞(Vero、MDCK)的活性高1.21～1.45倍。本研究鉴定获得了gI和gE基因的特异性siRNA,筛选出能够抑制MDV复制的靶位点,为MDV基因的功能和抗MDV病毒研究奠定了基础。