选择性捕获禽病原性大肠杆菌体内转录序列

采用选择性捕获转录序列(SCOTS)方法鉴定禽病原性大肠杆菌E037株(血清型O78)在感染SPF鸡过程中的转录表达基因。通过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增和SCOTS对cDNAs选择和致病性特异转录序列的富集,致病性特异的cDNAs被分离鉴定,共获得31个转录序列(命名为aec),其中分别有2、1、4、14、2和8个aec序列与黏附素、LPS的合成、铁的摄取系统、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因相关;从气囊中分离到16个aec序列,心包膜中分离到15个aec序列;有3种与质粒编码基因相关序列在气囊和心包膜中都被分离到。结果显示APEC致病性特异序列包括黏附素、LPS的合成、铁的转运、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因等。通过SCOTS方法建立了一种体内表达致病性特异基因的方法和APEC在自然宿主感染模型中致病性相关基因的表达谱的筛选方法。

禽病原性大肠杆菌tsh突变株的构建及分离株tsh基因的检测

运用基因重组方法将庆大霉素（Gentamycin,GM）抗性基因连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下此tshF-GM-tshR片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到含tsh基因的受体APEC E037株中,根据同源重组原理,筛选出tsh基因缺失的E037突变株,命名为E037（Δtsh）。E037和E037（Δtsh）株对1日龄鸡的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU,动物感染性试验表明E037（Δtsh）株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有明显下降。在243株禽源分离株中,有167株为tsh＋菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4%（146/167）、12.6%（21/167）和0%（0/167）;O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的89.5%-100%,而其它血清型的高致病株仅占其它分离株的53.3%,差异极显著（P〈0.01）。结果显示tsh＋株大多数为高致病性菌株,且其致病性与血清型的种类有一定的相关性,温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。

禽病原性大肠杆菌iro和tsh基因缺失株的构建

通过SSH和SCOTS研究,铁系统(Iro)和温度敏感性血凝素(Tsh)在禽病原性大肠杆菌(APEC)的感染中可能发挥重要作用。基因检测发现,在243个禽源大肠杆菌分离株中,有205株为iro+菌株,其中高、中度和低致病株分别为89.8%(184/205)、8.8%(18/205)和1.5%(3/205);有167株为tsh+菌株,高、中度、低致病株分别为87.4%(146/167)、12.6%(21/167)和0%(0/167),结果显示iro+或tsh+株大多数为高致病株。为了确定iro和tsh基因在APEC致病力中的作用,以APECE037株为基础,通过自杀性载体分别构建了iro和tsh基因缺失突变株E037(Δiro)、E037(Δtsh)和E037(ΔiroΔtsh)。动物感染性试验表明,突变株在鸡体内的繁殖能力和致病性均明显下降,但两个基因的协同致病作用不显著。进一步证实Iro和Tsh为APEC重要的致病因子。

禽病原性大肠杆菌的致病机理

1885年,Escherich氏分离并描述了大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),它构成了所有温血动物大肠中主要的需氧微生物菌群.……

禽病原性大肠杆菌致病因子的研究进展

禽大肠杆菌病是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌（APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病，可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、全眼球炎、气囊病、禽蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、卵黄囊感染等一系列病症，是2～12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。

响应面优化杂交构树叶黄酮提取工艺及对5种禽病原菌的抑制作用

本试验旨在优化杂交构树叶黄酮超声提取工艺,并检测其对禽重要致病菌的抑制作用。以杂交构叶为原料,乙醇为溶剂,在单因素(乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间)试验基础上,采用响应面法研究因素之间相互作用及对黄酮提取得率影响,获得最佳提取工艺为乙醇浓度60%,料液比1:49 g/mL,超声温度34℃,超声时间24 min,验证试验黄酮平均提取得率1.75%,接近1.77%的理论值;通过二倍稀释法检测杂交构叶黄酮对5种禽重要致病菌的抑制活性,最小抑菌浓度为6.25~50 mg/mL,表明杂交构叶黄酮抗菌活性显著,作为鸡饲料添加成分防治传染性细菌病研发应用前景广阔。本研究为杂交构叶黄酮开发为天然植物饲料添加成分及加速杂交构叶资源的综合开发利用提供科学依据。

嘉兴地区禽病原性大肠杆菌的分离鉴定

2005年，笔者从嘉兴地区临诊有典型大肠杆菌病病变的病、死鸡中分离到60株大肠杆菌，除9株未能定型、1株自凝外，鉴定出50个分离株的血清型，这些分离株覆盖了12个血清型（以078为最主要血清型）。对其中28株禽源性大肠杆菌进行致病性试验，有85．7％（24／28）为高致病株，10．7％（3／28）为中等致病株和3．6％（1／28）为低致病株。同时测定28个分离株对20种药物的敏感性。结果表明：壮观霉素、阿米卡星的抑菌作用最强，高敏菌株占71，4％～85，7％；痢特灵、庆大霉素、多粘菌素、卡那霉素、环丙沙星为中敏，高敏菌株为28，6％～64．3％；氧氟沙星、新霉素、甲基氟哌酸、依诺沙星、复方新诺明、磺胺甲基异垩唑、羧苄青霉素、青雹素、诺氰沙犀、罗姜沙犀、强力霍索、四环索的抑菌作用轮低．高敏菌株低千20％．

禽类隐孢子虫与其他病原感染相关性研究进展

隐孢子虫作为一种重要的胞内寄生原虫,感染谱广泛,主要侵犯呼吸道、胃肠道和法氏囊,禽类感染后主要表现为精神萎靡、腹泻、免疫低下和呼吸困难等临床症状。多重病原协同感染是近些年禽病的主要流行形式,禽类隐孢子虫作为一种重要的机会性致病病原,其感染与宿主的免疫功能直接相关,当器官/组织伴有其他病原同时感染时,可使疾病风险和防控难度加剧。目前,禽类隐孢子虫流行病学数据相对较少,与其他病原感染相关性研究尚不明朗。本文通过对国内外研究数据的梳理、归纳,对禽类隐孢子虫流行及其与呼吸道、消化道和法氏囊感染的其他病原的相关性进行综述,为进一步研究其间的协同致病机制奠定基础。

RPA检测技术在禽源病原检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification, RPA)是一种近年来研究者关注较多的新型恒温核酸扩增技术,该方法操作便捷、扩增速度快、特异性强及灵敏度高,无需借助精密仪器,且在恒温环境下(25~45℃)即可完成核酸检测,极有可能取代传统PCR检测技术。RPA检测技术迄今发展十余年,已广泛应用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及耐药基因检测等领域,被认为是当前最有潜力的快速分子诊断工具,具有较为广泛的应用前景。笔者就RPA检测、技术优势、常见检测方式及其在禽源病原检测方面的研究进展进行概述,旨在为临床禽源病原新型检测技术的研究提供一定理论参考。

禽病原性大肠杆菌aes-31基因突变株的构建和致病性鉴定

【目的】通过禽病原性大肠杆菌(APEC)aes-31突变株的构建和动物实验来初步鉴定此基因片段对E058株的毒力影响。【方法】对在芯片杂交试验中筛选到的APEC E058株体外表达差异基因片段aes-31(来自SSH方法筛选到的E058株特异片段),用SSH引物从重组质粒中扩增出目的片段,克隆到pGEM-Teasy Vector中,然后用SphⅠ和SpeⅠ从中切下此片段,将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性重组质粒pMEG375-aes-31,将突变载体转化到受体菌中,再和APEC E058株进行固相杂交,根据同源重组原理,筛选出基因突变株E058(Δaes-31)。【结果】E058株和突变株的LD50没有明显差别,突变株对35日龄SPF鸡的致死率高于E058株;两者接种鸡6 h内,E058(Δaes-31)突变株在各内脏器官和血液中的细菌数和E058株差异均不显著;接种鸡24 h后,E058(Δaes-31)突变株在脾脏和肺中的细菌数显著大于E058株,差异显著,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和血液中细菌数显著大于E058株,差异极显著;接种鸡48 h后,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和脾脏中的细菌数比E058株多,差异极显著,而肺脏和血液中的细菌数均无明显差异;48 h后突变株所引起的感染鸡的大肠杆菌病变比亲本株稍严重。【结论】以上数据表明aes-31有可能与E058株毒力的负调控有关。

禽病原性大肠杆菌温度敏感性血凝素(Tsh)突变株的构建

运用基因重组方法将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下目的片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到含tsh基因的受体APECE037株中,根据同源重组原理,筛选出tsh基因缺失的E037突变株。E037和E037(Δtsh)株的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU,动物感染性试验表明,E037(Δtsh)株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有了明显降低。

LAMP技术在禽源病原菌快速检测中的应用

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型恒温核酸扩增技术,在病原微生物的检测中具有特异性强、灵敏度高、设备简单、方便高效等优点。目前该技术已被成功应用于各类病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术在几种主要禽源病原菌检测中的应用,并展望LAMP技术的应用前景。

重组酶聚合及其在禽病原酶扩增技术检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术,它不同于传统的PCR扩增,恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增,具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强和操作简单等优点,具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、反应条件优化、产物检测方式、与其他恒温技术相比的优势及在禽病病原检测中应用,旨在为禽病病原检测新技术、新方法的研制提供参考。

PBL教学模式在兽医传染病实践环节教学中的应用——以禽病病原的诊断与分析为例

《兽医传染病学实验》是动物医学类专业学生实践教学的核心课程,是兽医传染病学课程的延伸和补充,在学生系统性学习兽医病理学、兽医微生物学、兽医免疫学理论课程和实验课程的基础上而开设的一门应用性和整体性较强的实践性课程。为进一步提升教学质量,笔者教学团队在《兽医传染病学实验》部分实验课教学中基于传统实验教学模式的基础上,引入PBL问题导向法新型教学模式,通过评价学生参与度、课堂气氛活跃度和对知识的掌握运用度,对此方法的教学效果进行初步探讨。结果显示,在PBL教学模式下,学生实验操作实践参与度高、课堂讨论积极,能够主动思考诊断病例信息,并能对疾病的诊断和后续的防治提出合理的建议。说明该方法有利于提高《兽医传染病学实验》的教学效果,帮助学生牢固掌握专业理论知识,是一种行之有效的教学方法。

禽霍乱病原菌对鸡致病力的研究

禽霍乱是鸡的一种急性败血性传染病,危害严重。有关学者对禽霍乱病原菌的生物学特性、致病性及免疫原性作了大量研究,但因该菌生物学特性不够稳定,给防治本病带来一定困难。为探索禽霍乱荚膜物质相同,菌体(O)物质不同,感染鸡体后,其侵袭力、增殖性和内毒素有无差异,我们于1990年选用C48—1和P1059两个不同血清型的菌株进行了对鸡致病力的研究。现将结果报告如下:

多重RT-PCR方法诊断多种禽呼吸道病原的混合感染

在一个RT-PCR反应体系中同时以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)等6种呼吸道病原的RNA或DNA为模板进行扩增RT-PCR。结果显示,6种病原都扩增出了相应大小的特异性产物,表明建立的多重RT-PCR方法可用于混合感染时上述6种病原的鉴别诊断。

禽源大肠杆菌的生物表型特性

对243株禽源大肠杆菌分离株进行血清耐受试验、菌毛化大肠杆菌血凝试验和温度敏感性血凝素试验,在这些分离株中,高度血清耐受、中等血清耐受、轻度血清耐受和血清敏感菌株分别占受试菌株的57.2%(139/243)、28.8%(70/243)、10.3%(25/243)和3.7%(9/243)。在37℃细菌培养物与鸡红细胞凝集试验中,甘露糖敏感血凝(MSHA)和甘露糖耐受血凝(MRHA)菌株分别占受试菌株的64.6%(157/243)和5.8%(14/243);与豚鼠红细胞凝集试验中,MSHA和MRHA菌株分别占受试菌株的74.9%(182/243)和2.9%(7/243),其中与鸡红细胞凝集试验MSHA菌株中,MSHA阳性菌株占高致病株的69.5%(132/190),MRHA阳性菌株占低致病株的22.2%(2/9),两者差异极显著(p<0.01)。在温度敏感性血凝素试验中,MRHA菌株为112株,占分离株的46.1%,其中O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的83%～100%,而其它血清型的高致病株仅占57%左右,差异显著(p<0.05)。结果显示禽源大肠杆菌的致病性与其血清耐受能力、鸡红细胞MSHA菌毛的表达和温度敏感性血凝素的表达呈一定的相关关系。

应用聚合酶链反应检测鉴别禽衣阿华支原体的研究

根据基因库中衣阿华支原体 (MI) 16 S r RNA基因序列 (Genebank M2 4 2 93) ,设计了一对跨幅为2 99bp的引物 ,用这对引物对 4禽株衣阿华支原体标准菌株和 6种其它禽病病原体进行 PCR扩增 ,结果 4禽株衣阿华支原体菌株均得到 3片段大小与预期设计相一致的 2 99bp的 PCR扩增产物 ,而其它 6种禽病病原体 (包括 MG、MS和 MM)的扩增结果则均为阴性 ,该 PCR能检出 1pg的衣阿华支原体的

用无特定病原体鸡监测产蛋鸡场血清抗体

为了监测产蛋鸡群中的禽病原体 ,在两个产蛋鸡场中放入无特定病原体 (SPF)鸡并与产蛋鸡一起喂养了 12个月。对SPF鸡分次采血并检测其对禽病原体的血清转化情况。结果 ,每个鸡场都在SPF鸡中检测到 8至 10种病原抗体产生的抗体。在混养的第一个月内就可以检出传染性支气管炎病毒 (IBV) ,禽肾炎病毒 ,鸡败血性霉形体和滑膜霉形体的抗体存在。IBV抗体滴度变化可以得到 :在试验的两个实验场里 ,产蛋鸡被IBV重复感染。但没有检出传染性法氏囊病病毒和其它 6种病原抗体。