选择性捕获禽病原性大肠杆菌体内转录序列

采用选择性捕获转录序列(SCOTS)方法鉴定禽病原性大肠杆菌E037株(血清型O78)在感染SPF鸡过程中的转录表达基因。通过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增和SCOTS对cDNAs选择和致病性特异转录序列的富集,致病性特异的cDNAs被分离鉴定,共获得31个转录序列(命名为aec),其中分别有2、1、4、14、2和8个aec序列与黏附素、LPS的合成、铁的摄取系统、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因相关;从气囊中分离到16个aec序列,心包膜中分离到15个aec序列;有3种与质粒编码基因相关序列在气囊和心包膜中都被分离到。结果显示APEC致病性特异序列包括黏附素、LPS的合成、铁的转运、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因等。通过SCOTS方法建立了一种体内表达致病性特异基因的方法和APEC在自然宿主感染模型中致病性相关基因的表达谱的筛选方法。

禽病原性大肠杆菌的致病机理

1885年,Escherich氏分离并描述了大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),它构成了所有温血动物大肠中主要的需氧微生物菌群.……

禽病原性大肠杆菌tsh突变株的构建及分离株tsh基因的检测

运用基因重组方法将庆大霉素（Gentamycin,GM）抗性基因连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下此tshF-GM-tshR片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到含tsh基因的受体APEC E037株中,根据同源重组原理,筛选出tsh基因缺失的E037突变株,命名为E037（Δtsh）。E037和E037（Δtsh）株对1日龄鸡的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU,动物感染性试验表明E037（Δtsh）株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有明显下降。在243株禽源分离株中,有167株为tsh＋菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4%（146/167）、12.6%（21/167）和0%（0/167）;O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的89.5%-100%,而其它血清型的高致病株仅占其它分离株的53.3%,差异极显著（P〈0.01）。结果显示tsh＋株大多数为高致病性菌株,且其致病性与血清型的种类有一定的相关性,温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。

禽病原性大肠杆菌iro和tsh基因缺失株的构建

通过SSH和SCOTS研究,铁系统(Iro)和温度敏感性血凝素(Tsh)在禽病原性大肠杆菌(APEC)的感染中可能发挥重要作用。基因检测发现,在243个禽源大肠杆菌分离株中,有205株为iro+菌株,其中高、中度和低致病株分别为89.8%(184/205)、8.8%(18/205)和1.5%(3/205);有167株为tsh+菌株,高、中度、低致病株分别为87.4%(146/167)、12.6%(21/167)和0%(0/167),结果显示iro+或tsh+株大多数为高致病株。为了确定iro和tsh基因在APEC致病力中的作用,以APECE037株为基础,通过自杀性载体分别构建了iro和tsh基因缺失突变株E037(Δiro)、E037(Δtsh)和E037(ΔiroΔtsh)。动物感染性试验表明,突变株在鸡体内的繁殖能力和致病性均明显下降,但两个基因的协同致病作用不显著。进一步证实Iro和Tsh为APEC重要的致病因子。

嘉兴地区禽病原性大肠杆菌的分离鉴定

2005年，笔者从嘉兴地区临诊有典型大肠杆菌病病变的病、死鸡中分离到60株大肠杆菌，除9株未能定型、1株自凝外，鉴定出50个分离株的血清型，这些分离株覆盖了12个血清型（以078为最主要血清型）。对其中28株禽源性大肠杆菌进行致病性试验，有85．7％（24／28）为高致病株，10．7％（3／28）为中等致病株和3．6％（1／28）为低致病株。同时测定28个分离株对20种药物的敏感性。结果表明：壮观霉素、阿米卡星的抑菌作用最强，高敏菌株占71，4％～85，7％；痢特灵、庆大霉素、多粘菌素、卡那霉素、环丙沙星为中敏，高敏菌株为28，6％～64．3％；氧氟沙星、新霉素、甲基氟哌酸、依诺沙星、复方新诺明、磺胺甲基异垩唑、羧苄青霉素、青雹素、诺氰沙犀、罗姜沙犀、强力霍索、四环索的抑菌作用轮低．高敏菌株低千20％．

禽病原性大肠杆菌aes-31基因突变株的构建和致病性鉴定

【目的】通过禽病原性大肠杆菌(APEC)aes-31突变株的构建和动物实验来初步鉴定此基因片段对E058株的毒力影响。【方法】对在芯片杂交试验中筛选到的APEC E058株体外表达差异基因片段aes-31(来自SSH方法筛选到的E058株特异片段),用SSH引物从重组质粒中扩增出目的片段,克隆到pGEM-Teasy Vector中,然后用SphⅠ和SpeⅠ从中切下此片段,将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性重组质粒pMEG375-aes-31,将突变载体转化到受体菌中,再和APEC E058株进行固相杂交,根据同源重组原理,筛选出基因突变株E058(Δaes-31)。【结果】E058株和突变株的LD50没有明显差别,突变株对35日龄SPF鸡的致死率高于E058株;两者接种鸡6 h内,E058(Δaes-31)突变株在各内脏器官和血液中的细菌数和E058株差异均不显著;接种鸡24 h后,E058(Δaes-31)突变株在脾脏和肺中的细菌数显著大于E058株,差异显著,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和血液中细菌数显著大于E058株,差异极显著;接种鸡48 h后,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和脾脏中的细菌数比E058株多,差异极显著,而肺脏和血液中的细菌数均无明显差异;48 h后突变株所引起的感染鸡的大肠杆菌病变比亲本株稍严重。【结论】以上数据表明aes-31有可能与E058株毒力的负调控有关。

禽病原性大肠杆菌温度敏感性血凝素(Tsh)突变株的构建

运用基因重组方法将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下目的片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到含tsh基因的受体APECE037株中,根据同源重组原理,筛选出tsh基因缺失的E037突变株。E037和E037(Δtsh)株的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU,动物感染性试验表明,E037(Δtsh)株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有了明显降低。

禽病原性大肠杆菌致病因子的研究进展

禽大肠杆菌病是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌（APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病，可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、全眼球炎、气囊病、禽蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、卵黄囊感染等一系列病症，是2～12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。

禽源大肠杆菌的生物表型特性

对243株禽源大肠杆菌分离株进行血清耐受试验、菌毛化大肠杆菌血凝试验和温度敏感性血凝素试验,在这些分离株中,高度血清耐受、中等血清耐受、轻度血清耐受和血清敏感菌株分别占受试菌株的57.2%(139/243)、28.8%(70/243)、10.3%(25/243)和3.7%(9/243)。在37℃细菌培养物与鸡红细胞凝集试验中,甘露糖敏感血凝(MSHA)和甘露糖耐受血凝(MRHA)菌株分别占受试菌株的64.6%(157/243)和5.8%(14/243);与豚鼠红细胞凝集试验中,MSHA和MRHA菌株分别占受试菌株的74.9%(182/243)和2.9%(7/243),其中与鸡红细胞凝集试验MSHA菌株中,MSHA阳性菌株占高致病株的69.5%(132/190),MRHA阳性菌株占低致病株的22.2%(2/9),两者差异极显著(p<0.01)。在温度敏感性血凝素试验中,MRHA菌株为112株,占分离株的46.1%,其中O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的83%～100%,而其它血清型的高致病株仅占57%左右,差异显著(p<0.05)。结果显示禽源大肠杆菌的致病性与其血清耐受能力、鸡红细胞MSHA菌毛的表达和温度敏感性血凝素的表达呈一定的相关关系。

一株溶原性禽大肠杆菌的特征鉴定

禽致病性大肠杆菌是引起养禽业经济损失的主要病原菌之一。本研究对从病死的禽血液分离到的一株疑似大肠杆菌进行了表型和基因型的研究。该菌在麦康凯固体培养基上形成粉红色菌落,16S rRNA PCR鉴定结果显示该分离株与禽病原性大肠杆菌部分菌株的16S rRNA序列的同源性达到了99%。该菌株在半固培养基上不具有运动性。用MLST分型特异引物对菌株的基因型进行鉴定,发现该菌株属于ST10型。在电镜下,菌体表面可见鞭毛和菌毛,并可见噬菌体结构,这提示噬菌体入侵导致的细胞内容物释放可能是在该菌形成黏性菌落的原因。本研究为进一步确定噬菌体在细菌致病中和进化中的作用提供了必要的基础。

一株溶原性鸡大肠杆菌的分子特征鉴定

为了鉴定和了解实验室保存的1株溶原性鸡大肠杆菌的病原学特性,试验对其遗传进化和基因型等进行了分子特征鉴定。结果表明:鸡大肠杆菌Leco13的16S rRNA与大肠杆菌K12标准株16S rRNA部分序列的同源性达到了99%;用MLST分型特异引物对菌株的基因型进行鉴定,发现该菌株属于ST10型。同时参考其他文献中的噬菌体提取方法,对分离株进行了噬菌体的提取,成功提取噬菌体DNA后,用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定并获得了较为清晰的酶切图谱。