禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

A、B、J亚群禽白血病病毒混合感染的鉴定及gp85基因序列分析

【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组织接种DF-1细胞进行病毒分离,通过PCR、ELISA及间接免疫荧光试验(IFA)等方法进行亚群鉴定,进一步对分离株gp85基因的相似性和变异情况进行分析。【结果】剖检结果可见病死鸡肾脏、脾脏肿大,肺脏出血,表面可见灰白色肿瘤结节;组织匀浆接种DF-1细胞后,ELISA检测发现细胞上清P27抗原呈阳性;IFA检测发现,感染细胞里有特异性绿色荧光;PCR鉴定能同时扩增出A(692 bp)、B(847 bp)和J(545 bp)亚群的特异性条带。鉴定结果表明,从该病死鸡中分离到A、B和J亚群ALV毒株,分别命名为HBYC2022-A、HBYC2022-B和HBYC2022-J。分离株gp85基因核苷酸相似性分析显示,HBYC2022-A与江苏株JS-A1201相似性最高,为99.6%;HBYC2022-B与江苏株JS-B1204相似性最高,为99.7%;而HBYC2022-J与黑龙江株PK19FA01、广西株GX20YL12 J及安徽株AHaq02相似性均为100%。此外,分离株gp85基因高突变区域(hr1、hr2)氨基酸序列并未出现特殊点突变。【结论】鸡群存在A、B和J不同亚群ALV的混合感染情况,提示国内养禽场需提高警惕并加强针对ALV各亚群的流行病学调查。

不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公司ELISA试剂盒的灵敏度,还进一步评估了胎粪样品直接ELISA检测与血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测2种评估方法的灵敏度,为科学选择灵敏特异的ALV检测方法提供了良好评价模型。

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp 85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为90.5%~95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%~99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp 85基因片段长度为1008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为89.4%~92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%~99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp85蛋白氨基酸序列均会发生突变,但高变区hr1和hr2所占比例较多,证实了gp85的高变性。在gp85蛋白B细胞抗原表位中存在部分位点的氨基酸突变,可能导致gp85蛋白抗原性发生变化。间接免疫荧光鉴定结果显示,5株分离毒株均可在DF-1细胞内复制并存在可被抗体识别的p27抗原表位。结果表明,本试验分离的7株ALV毒株是国内ALV-J和ALV-K流行毒株的突变株,不仅丰富了ALV基因组库资源,且为后续研究ALV的遗传变异特征和流行趋势等提供参考依据。

E3泛素连接酶FBXL8对A亚群禽白血病病毒复制的影响

【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL 8基因,构建鸡源FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,将其转化大肠杆菌表达菌株RIL进行诱导表达及纯化,将表达产物His-FBXL8免疫10月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA分别检测抗体特异性及效价;针对已公布的FBXL 8基因序列设计过表达引物及靶向FBXL 8基因的干扰序列,构建过表达质粒psi-flag-FBXL8及干扰质粒pLKO.1-FBXL8-shRNA,使用Western blotting检测其表达效果。将构建成功的过表达质粒和干扰质粒转染DF-1细胞,24 h后感染ALV-A,通过半定量PCR、Western blotting分别检测ALV-A的结构蛋白P27、GP85表达水平。【结果】PCR成功扩增出大小为1182 bp的FBXL 8基因片段,并成功构建FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,诱导表达的融合蛋白His-FBXL8大小为43 ku。Western blotting和间接ELISA结果显示,制备的FBXL8兔多克隆抗体可特异性识别外源蛋白,且抗体效价为1∶64000。成功构建了FBXL8过表达质粒和干扰质粒,其在DF-1细胞中能够实现对FBXL8的过表达和敲低。半定量PCR和Western blotting检测结果显示,过表达FBXL8可抑制ALV-A复制,而敲低FBXL8则促进其复制。【结论】本研究制备的FBXL8多克隆抗体具有良好特异性及反应性;在DF-1细胞中,FBXL8负向调控ALV-A复制,研究结果为进一步深入探究FBXL8生物学特性提供了重要参考,并为揭示FBXL8抗ALV-A感染分子机制奠定了基础。

与鸡内皮血管瘤病例相关的禽白血病病毒K亚群分离及其gp85基因演化分析

本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡群为父母代花鸡,发病率约为2%,剖检无其他肉眼表观病变,病理组织学诊断为内皮血管瘤。RT-PCR检测肿瘤组织表明为K亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染,无其他禽肿瘤性病毒感染。对患病鸡的血浆样品(32份)、肿瘤组织匀浆(6份)及脑组织匀浆(6份)进行病毒的分离鉴定,成功从脑组织样品中分离到4个ALV-K毒株(GXJL01~GXJL04)。使用特异性引物扩增GXJL01~GXJL04的env基因并测序,在与华南地区其他5个规模化种禽场中分离获得的7个ALV-K流行株的gp85基因的遗传演化分析中表明,GXJL01~GXJL04与日本的Km5844、Sp53等神经胶质瘤毒株(fowl glioma-inducing virus, FGV)及具有神经组织嗜性的ALV-K毒株JS15SG01同一进化分支上,与本研究其他7个ALV-K分离株的遗传进化关系较远。同时在针对ALV-K的gp85蛋白氨基酸位点突变分析中发现,GXJL01~GXJL04存在多个与FGV和JS15SG01参考株相似的氨基酸位点突变。本研究首次把地方黄羽鸡品种花鸡头部的肿块诊断为内皮血管瘤,且ALV-K为内皮血管瘤的主要相关病原,分离株GXJL01~GXJL04区别于现行华南地区ALV-K流行株且与FGV、JS15SG01等神经组织嗜性的毒株高度同源。

J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立

为缩短J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)检测周期,进一步加快禽白血病净化进程,本研究结合SYBR GreenⅠqPCR和混样检测,建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术(ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction, ALV-J-B-qPCR)。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列,设计ALV-J的特异性引物,并优化反应条件,建立了ALV-J SYBR GreenⅠqPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料,分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测,筛选最佳检测模板;进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法,血液混样总体积为200μL的混样方法,血液混样总体积为10μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性,筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法,成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验,并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示,该方法仅特异性扩增ALV-J,对标准质粒的最低检测限度为1×10^(2)copies·μL^(-1),批内与批间变异系数均<1%。对90份临床送检血液样品的检测结果显示,该qPCR方法对ALV-J的检出率(15.6%)高于p27抗原ELISA和普通PCR的检出率(12.2%)。检测模板筛选试验中,抗凝血DNA最符合检测准确度高、操作复杂度和成本低的要求,为最佳检测模板。混样方法摸索试验中,混样总体积为10μL(混样规模<12份)的混样方法检测准确性最高,为最佳混样方法。在样本数为400份,预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%,比病毒分离法高2.00%;在样本数为400份,预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%,比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势,为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

E亚群禽白血病病毒分离株的全基因组序列分析

为了弄清江苏省某一地方品种种鸡场病死鸡的死亡原因,采集病死鸡组织,检测显示仅为ALV阳性;通过CEF和DF-1细胞培养、p27抗原检测和间接免疫荧光(IFA)对病毒进行鉴定;对病毒分离株前病毒DNA序列进行全基因组序列测定与分析。结果显示:分离株能够在CEF上生长,上清液中可检测到p27抗原,CEF出现特异性绿色荧光,DF-1细胞培养物以上检测均为阴性,初步表明分离株为ALV-E,命名为JY202106;其基因组大小为7529 bp,符合复制完整型C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因;序列分析显示,分离株与参考株同源性为84.3%~98.7%,gp85进化分析分离株与ALV-E同属一个进化分支,与ev-1株同源性高达99.2%。研究表明地方品种鸡中存在内源性ALV,为该病的防控提供了参考和依据,也丰富了ALV基因组数据资料。

6株K亚群禽白血病病毒分离株的全基因组测序及遗传进化分析

为研究目前中国临床流行的ALV毒株特征,我们采集临床上ALV P27阳性的鸡的血浆,接种DF-1细胞进行病毒分离,分离出6株外源性ALV毒株,并进一步对分离毒株进行前病毒全基因组测序。结果表明,6个ALV分离株的基因组结构均为典型的复制完整型C型逆转录病毒,缺乏病毒致癌基因,分离株DT190901基因组全长为7473 bp;DT190902和DT190905为7467 bp;DT190903和DT190906为7481 bp;DT190904为7493 bp,分离株间基因组序列同源性较高(98.6%~99.9%)。对6个ALV分离株与其他ALV毒株进行序列比较和遗传进化分析,结果表明,分离株的LTR、gag、pol及gp37基因与内源性ALV相比具有较高同源性(>93.8%),gp85基因与ALV-K一致性较高(>95.4%),属于新型ALV亚群(K亚群)遗传分支。分离株的LTR序列与内源性ALV相似,比其他外源性ALV亚群缺少一个CAAT Box、PRE Box、Y Box及CArG Box等转录调控元件。结果表明这6个分离株属于ALV-K亚群,为ALV-K与内源性ALV的重组毒株,其LTR序列与内源性ALV接近可能导致其复制能力及致病性降低。遗传进化分析表明,ALV-K已经在我国局部流行,并出现基因重组和突变毒株,应该引起重视并改进净化防控措施控制ALV-K流行。

禽白血病病毒与多种病原协同致病机理研究进展

禽白血病(Avian leukosis,AL)是一类由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的禽类肿瘤性传染病。近年来,除ALV不同亚群的感染被报道以外,ALV也常被发现与其他病原共同感染,发病机制尚不明确,每年给家禽养殖行业造成严重的经济损失。文章对ALV的基因组特征、复制特点、基本致病机理、与其他禽类免疫抑制性病毒、细菌和寄生虫等病原的协同致病机理等进行了综述,为AL的防控提供更具有针对性的指导意见。

tva受体基因起始密码子突变对鸡感染A亚群禽白血病病毒的影响

[目的]探索tva受体基因起始密码子突变(tva c.3G>A)对鸡感染A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A, ALV-A)的影响。[方法]利用Sanger测序和RT-PCR验证我国黄羽肉鸡存在tva c.3G>A突变。利用流式细胞术检测tva c.3G>A突变对鸡体外感染RCASBP(A)-GFP荧光报告病毒的影响。通过ALV-A体内攻毒试验,探究tva c.3G>A突变对鸡体内感染ALV-A的影响。利用直接测序方法对我国黄羽肉鸡品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。[结果]Sanger测序和RT-PCR结果鉴定我国黄羽肉鸡品系tva基因编码区第3位碱基由G突变为A,该突变引起tva基因起始密码子序列由ATG突变为ATA。流式细胞术检测结果显示野生型tva c.3G/G鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast, CEF)对RCASBP(A)-GFP易感,纯合突变型tva c.3A/A CEF抗RCASBP(A)-GFP感染,表明tva c.3G>A突变导致鸡体外抗RCASBP(A)-GFP的感染。ALVA体内攻毒试验的结果表明,tva c.3G>A突变导致鸡体内抗ALV-A的感染。tva c.3G>A突变位点基因分型发现,CB01、CB08、CB10和CB15品系存在纯合抗性基因型tva c.3A/A,频率分别为0.10、0.15、0.23和0.08。[结论]tva c.3G>A突变引起鸡在体外、体内抗ALV-A感染,tva c.3G>A突变位点可作为ALV-A的遗传抗性位点。

长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与禽白血病病毒抗性和易感品系鸡相关性分析

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中的表达规律及其与禽白血病病毒抗性的相关性,本研究通过荧光定量PCR发现,lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性(G1)品系鸡免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)和CEF细胞中的表达水平显著高于ALV易感(G3)品系鸡。病毒感染实验表明lnc-ALVE1-AS1在ALVJ感染CEF(G1和G3来源)细胞24h和96h后均显著下调;但是,lnc-ALVE1-AS1在G3来源CEF细胞中的表达水平下降更为明显,且ALVJ病毒复制水平显著高于G1鸡来源的CEF细胞。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1不仅可以显著上调G3来源CEF细胞dsRNA识别受体(TLR3和IFIH1)和抗病毒天然免疫基因(IFI27-L2、IFIT5、IFITM3、IFN-β、ISG12-2和RASD2)表达,还显著抑制ALVJ复制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在禽白血病病毒抗性和易感品系鸡细胞和免疫组织器官中的表达规律和抗病毒功能,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

不同检测技术在K亚群禽白血病病毒检测中的应用

禽白血病(avian leukosis,AL)以垂直传播为主,被列为我国种禽场必须要实现净化的主要禽病之一,通过1日龄雏鸡胎粪检测淘汰等程序是实施AL净化的主要步骤之一。K亚群禽白血病病毒(ALV-K)是近年来在黄羽肉鸡群中流行的主要亚群。为比较不同检测方法对ALV-K的灵敏度差异,将ALV-K经卵黄囊接种感染SPF鸡胚后构建垂直感染模型,对1日龄雏鸡采集胎粪和抗凝血,接种DF-1细胞后进行病毒分离,维持7 d收取细胞上清。收集胎粪以及胎粪和抗凝血的病毒分离细胞上清等样品构建样品盘,分别以磁微粒化学发光检测试剂盒、3家公司ELISA试剂盒、胶体金检测试纸条等进行检测。结果显示,确定样品盘利用不同检测方法的阳性检出率均为100%,各检测技术检出结果一致;但不同方法的灵敏度有差异,其中磁微粒化学发光技术灵敏度优势明显,可更好地判定ALV垂直传播状态。本研究提出了一种可评估不同检测技术灵敏度的良好模型,为进一步理解不同检测技术用于AL净化的价值提供了参考。

竹醋液抑制J亚群禽白血病病毒复制研究

为探讨竹醋液在体外对J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)复制的影响,研究首先通过CCK-8试剂盒测定青皮竹和慈竹两种竹醋液对DF-1细胞毒性,随后将不同浓度竹醋液与ALV-J等体积室温作用不同时间后接种到细胞中,利用qRTPCR、ELISA和Western blot测定竹醋处理对ALV-J编码基因的转录以及蛋白合成的影响。结果显示:两种竹醋液加入细胞中的最终浓度均≤2%,对细胞生长没有影响;青皮竹醋和慈竹醋在100%、50%、25%的浓度下与病毒在室温作用10 min、30 min后,细胞中gp37基因表达水平显著下降,细胞与上清中的P27蛋白表达水平也明显下降。研究表明,青皮竹醋和慈竹醋在体外均有明显的抗ALV-J活性。

E3泛素连接酶RNF165在A亚群禽白血病病毒复制中的作用

【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时荧光定量PCR方法分别从体外和体内两个方面验证ALV-A对宿主RNF165表达的影响;参考已公布的RNF165基因序列设计过表达引物,通过PCR扩增RNF165基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1;将验证表达的重组质粒转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,使用Western blotting检测过表达RNF165对病毒复制的影响;最后设计突变引物,构建RNF165功能结构域突变质粒,将过表达质粒和突变质粒分别转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,Western blotting测定gp85蛋白表达差异。【结果】ALV-A感染DF-1细胞后未能检测到内源性的RNF165蛋白,但基因转录水平较对照组明显下调(P<0.01)。在体内试验中,与对照组相比,感染病毒雏鸡肝脏中RNF165基因和蛋白表达水平均有所下调(P<0.01);通过PCR成功扩增到大小为1068 bp的目的片段并成功克隆至pcDNA3.1,Western blotting结果显示,在39 ku处出现目的条带,RNF165过表达后促进了病毒复制;测序结果显示,成功构建出功能结构域突变质粒,与过表达质粒组相比,RNF165突变质粒组病毒的复制水平受到显著抑制。【结论】ALV-A感染抑制DF-1细胞和雏鸡肝脏RNF165的表达,在体外试验中,过表达RNF165会促进ALV-A的复制,且这种影响与其保守结构域有关。

鸡IFIT5对J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞内复制的影响

【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5。pET-28a-IFIT5可以表达约56 ku的可溶性蛋白His-IFIT5,Western blotting结果显示,制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的IFIT5蛋白,效价为1∶32 000。pcDNA5-flag-IFIT5能在DF-1细胞中高效表达,且在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。【结论】本研究制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体具有较高的反应性和特异性;在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。本试验结果为深入研究IFIT5蛋白的生物学功能提供参考。

1株J亚群禽白血病病毒env基因克隆及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行测序,利用SeqMan拼接env基因。将该env基因与国内外多个ALV亚群进行序列比对及遗传进化分析,并借助多种生物信息学软件对env蛋白进行分析,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、乙酰化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位预测。【结果】ALV-J毒株的env基因全长1719 bp,获得GenBank登录号为OP837418,其与J亚群ALV位于同一进化分支,相似性为89.3%~94.8%。该env蛋白有2个跨膜区,是由572个氨基酸组成的不稳定的亲水蛋白,不稳定系数预测值为43.49,总平均亲水性为―0.201;该env蛋白为非分泌蛋白,无信号肽,有17个N-糖基化修饰位点、77个O-糖基化修饰位点、42个磷酸化修饰位点、21个潜在抗原决定簇和9个连续碱基数超过10个的B细胞线性表位。该env蛋白的二级结构中无规则卷曲占比最大,为38.29%。【结论】env基因是导致ALV遗传变异的关键基因,其编码的囊膜蛋白env具有不稳定性,存在多个蛋白修饰位点和抗原表位。

K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

北京信鸽中1株禽白血病病毒的分离和鉴定

为研究北京地区信鸽中禽白血病(AL)的流行情况,本试验从北京市沙河地区某市场抽样采集疑似AL信鸽血液样本共54份,通过检测p27抗原对其进行禽白血病病毒(ALV)鉴定;将分离株接种SPF鸡后检测其血清中ALV-Ab和ALV-J抗体,对分离株env基因进行扩增和测序,与各亚型ALV参考株gp 85基因核苷酸序列进行同源性分析,并构建系统发育进化树。结果显示,从54份样本中分离得到1株ALV,命名为CAU1501。ALV-J抗体检测全部呈阴性,ALV-Ab抗体检测有4份呈阳性。CAU1501的gp 85基因核苷酸序列与2007年美国分离株PDRC-3249同源性最高,与国内2009年山东分离株SDAU09E2遗传亲缘性最近,结合抗体检测结果确定分离株CAU1501为A亚群ALV。本试验结果可为后续北京地区鸽群AL的防控和净化提供参考依据。

禽内源白血病病毒ev3、ev6和ev21对雏鸡免疫器官指数和血清指标的影响

试验旨在探究禽内源性白血病病毒ev3、ev6和ev21对雏鸡免疫性能的影响。试验利用PCR技术检测太行鸡、大午金凤雏鸡的羽型和ev3、ev6、ev21整合性,测定雏鸡的体重、免疫器官指数,利用ELISA技术检测雏鸡血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)含量。结果显示,ev3在太行鸡的整合阳性率显著高于大午金凤鸡(P<0.05)。ev3整合阳性太行鸡的法氏囊指数显著高于阴性个体(P<0.05),体重显著低于阴性个体(P<0.05)。ev21阴性太行鸡体重显著高于阳性鸡(P<0.05)。太行鸡母鸡体重和免疫器官总重显著高于公鸡(P<0.05)。ev3阳性太行鸡血清IgG和IL-4含量显著高于ev3阴性鸡(P<0.05)。ev6阳性太行鸡血清IL-10含量显著低于ev6阴性鸡(P<0.05)。ev3阳性大午金凤鸡血清IgM含量显著低于ev3阴性鸡(P<0.05)。ev21阳性慢羽大午金凤公鸡血清IL-4含量显著高于ev21阴性快羽母鸡(P<0.05)。太行慢羽鸡和母鸡的血清IgG含量显著高于快羽鸡和公鸡(P<0.05)。ev21阴性太行快羽鸡血清IgG含量显著低于ev21阴性太行慢羽鸡和ev21阳性太行慢羽鸡(P<0.05)。研究表明,ev3整合提高了1日龄太行鸡的免疫性能,降低了其体重和大午金凤鸡血清IgM含量;ev6整合降低了太行鸡血清IL-10含量;ev21整合降低了1日龄太行鸡的体重,提高了大午金凤鸡血清IL-4含量。