禽网状内皮组织增生病毒gp90全长蛋白的原核表达、表达形式鉴定与纯化

该研究将禽网状内皮组织增生病毒gp90基因克隆至原核表达载体pET-30a(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定蛋白表达情况和蛋白表达.结果发现,将gp90基因连接表达载体转化宿主菌后,成功在大肠杆菌以包涵体形式表达.纯化的蛋白纯度超过90%.

新城疫活疫苗La Sota株免疫增强了禽网状内皮组织增生病毒对SPF鸡的致病作用

禽网状内皮组织增生病毒(REV)是鸡群中常见的垂直传播性病毒之一,感染后可导致鸡群发生严重的免疫抑制,对于一些未净化REV的鸡群,在免疫新城疫活疫苗后某些鸡会加重发病趋势,怀疑通过鸡胚感染的REV和新城疫活疫苗在体内发挥了协同致病作用,为此本研究开展了模拟实验。从100枚SPF鸡胚中随机选择50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种REV,剩余50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种灭菌PBS。待孵化出雏后鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时免疫新城疫活疫苗(La Sota株),同时鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时接种PBS。结果显示:携带有REV的雏鸡再免疫活疫苗La Sota株后首先出现死亡,其体重明显低于其他组SPF鸡体重,免疫器官损伤程度比REV单独感染组更加严重,且显著高于对照组。本研究结果表明新城疫活疫苗La Sota株免疫后增强了REV对SPF鸡的致病作用,提示我们选择净化种源的重要性。

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定及其env基因序列分析

某寿光鸡群发生肿瘤病例,从瘦小的鸡中随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽白血病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生病毒(REV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等三种肿瘤病毒的分离和鉴定,结果显示ALV和REV均为阴性,但分离到3株REV(SD1301、SD1302和SD1303)。对3株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析,结果显示3株REV之间的env基因核酸同源性为100%,与国内参考毒株比较显示,3株REV分离自中国黑龙江的HLJR0901缘关系最近。本研究显示了地方品系鸡中REV感染的存在,表明要加强对我国地方品系中REV的检测和净化。

禽网状内皮组织增生病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生病毒（REV）属于反转录病毒属。此病毒主要感染火鸡、鹅、鸡、鹤鹑和鸭等禽类并引起以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性病理综合征。禽网状内皮组织增生病与鸡马立克氏病（MD）和鸡淋巴细胞白血病（AL）均是禽病毒性肿瘤性疾病，且都可以引起严重的免疫抑制。目前，因为REV等免疫抑制性疾病所造成的直接或由于疫苗带毒所造成的间接损失已日益成为影响养禽生产和养殖效益的严重因素。

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定

对发生肿瘤的某寿光鸡群随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽网状内皮组织增生病毒(REV)的分离和鉴定。分离到2株REV,对2株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析,结果显示,2株REV之间的env基因核酸同源性为99.8%,与分离自中国黑龙江的HLJR0901和分离自中国台湾的Chicken/3337/05亲缘关系最近。

3种方法检测禽网状内皮组织增殖病毒人工感染鸡胚孵化雏鸡的带毒比较

为比较血液和粪便等样品采用不同方法检测禽网状内皮组织增殖病毒(REV)的准确率,从而为制定禽网状内皮组织增殖病(RE)净化程序提供参考,利用鸡胚卵黄囊接种构建REV垂直传播感染雏鸡模型,分别采用DF-1细胞病毒分离、RT-PCR检测和荧光定量RT-PCR检测,对1日龄雏鸡血液和胎粪样品,7~70日龄鸡(每隔1周)的血液和泄殖腔棉拭子样品,进行REV检测和结果比较。结果显示:对1日龄出壳的SPF鸡血浆进行检测,荧光定量RT-PCR灵敏度最高,阳性检出率为100%(25/25),其次为病毒分离,阳性检出率为96%(24/25),RT-PCR检出率最低;对1日龄出壳的SPF鸡胎粪进行检测,荧光定量RT-PCR与病毒分离灵敏度一致,阳性检出率均为80%(20/25),RT-PCR检出率最低,为28%(7/25)。对7~70日龄鸡(每隔1周)进行血液和泄殖腔棉拭子检测,3种方法阳性检出率与1日龄检测情况总体相似,检出率从高到低依次为荧光定量RT-PCR、病毒分离和RT-PCR。结果表明,在同一检测时间点使用同一检测方法,胎粪/泄殖腔棉拭子REV阳性检出率基本低于血液检出率。本研究初步比较了不同方法检测REV人工感染鸡胚孵化雏鸡的带毒情况,为实施REV净化奠定了基础。

IFN-α对禽网状内皮组织增殖病病毒体内外增殖的抑制作用

为明确禽源α干扰素(IFN-α)对禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)体内外增殖的抑制效果,本试验在细胞和动物水平上分别采用鸡胚成纤维(DF-1)细胞和海兰褐鸡作为模型,于REV接种前(预防)和接种后(治疗)分别添加不同浓度的禽IFN-α处理,分析禽IFN-α在体外和体内对REV增殖的影响。体外试验结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为33 IU/mL的治疗组72 h细胞和上清中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05),禽IFN-α浓度为33 IU/mL的预防组72 h细胞中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05)。通过比较各组海兰褐鸡的平均体重、血液中REV阳性率和病毒载量、泄殖腔REV阳性率和排毒量、免疫器官指数和病毒载量系统评估禽IFN-α对REV体内增殖的影响,结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为1 500 IU的治疗组海兰褐鸡21和28日龄时体重显著升高(P<0.05),14日龄时肝脏发育指数以及14和28日龄时的脾脏发育指数显著降低(P<0.05),14日龄时血液和脾脏中病毒载量显著降低(P<0.05),7和21日龄时泄殖腔排毒量显著降低(P<0.05)。本试验在体外细胞和体内动物2个层面均证实了禽IFN-α对REV增殖具有显著的抑制效果,这不仅为禽网状内皮组织增殖病的防控策略提供了新的思路和辅助手段,也为未来抗病毒药物的研发和应用提供了科学依据。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

一例肉鸡网状内皮组织增生症病毒与圆圈病毒混合感染的实验室诊断

黑龙江地区某养殖场,28日龄商品肉鸡出现精神萎靡,采食量下降,生长缓慢的症状,发病鸡在眼、鼻、喙部位出现溃疡结痂。病鸡剖检病理变化主要是腺胃出血、乳头肿胀,肾脏肿大、脾脏出血坏死、法氏囊萎缩、肠炎等,病原学核酸检测结果表明该鸡场存在禽网状内皮组织增生症病毒和圆圈病毒3型的混合感染。本病例的实验室诊断为家禽疫病防控提供了部分理论基础和有效参考。

黔东南小香鸡种群禽白血病、禽网状内皮组织增生症和鸡白痢感染情况检测与分析

为了解黔东南小香鸡种群禽白血病(AL)、禽网状内皮组织增生症(RE)和鸡白痢(PD)的感染状况,便于有效预防、净化疫病,更好地保护黔东南小香鸡的种质资源,从鸡群采集524份血清样品,采用ELISA检测禽白血病病毒p27抗原(ALV-p27)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)及鸡白痢感染抗体水平,采用PCR核酸检测进行禽白血病病毒A、B、J亚群(ALV-A、B、J)鉴定。结果表明:样品中ALV-p27抗原的阳性率为85.88%、ALV-J亚群的阳性率42.67%,REV抗体的阳性率为25.57%,鸡白痢抗体的阳性率为3.82%。根据检测结果,建议尽早对种群采取净化措施,以避免AL进一步发生及流行。

禽网状内皮组织增生病毒gp90蛋白的原核表达与纯化

为了研究禽网状内皮组织增生病毒(REV)gp90蛋白的生物学功能和免疫学功能,合成了gp90蛋白基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET-22b(+)上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定了蛋白表达情况和蛋白表达形式。使用小规模蛋白纯化系统将表达的蛋白进行了纯化。结果表明:将gp90蛋白基因连接表达载体转化宿主菌后,成功在大肠杆菌上以包涵体形式表达,纯化的蛋白纯度超过90%。

禽网状内皮组织增生症及其危害

禽网状内皮组织增生症(RE)是由网状内皮组织增生症病毒(REV)引起的禽类的一种重要的免疫抑制性和致瘤性疾病。近年来,国内外鸡群中REV流行逐渐严重,是养禽业健康发展的重要威胁之一。本文综述了REV的分子病原学、流行病学,以及直接和间接危害,对人们更好地认识和防控该病具有重要意义。

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。

鸡肿瘤病料中马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的研究

采用细胞培养、间接荧光抗体试验(IFA)、聚合酶链式反应 (PCR)和斑点杂交 (Dotblot)的方法从我国不同地区发生肿瘤的病料中同时进行MDV和REV的分离和鉴定。在分离到的 1 3株MDV野毒株中 ,有 4株培养物既能在IFA中与REV的单抗反应 ,又可以用PCR扩增出REV的LTR ;另有 4株培养物能扩增出REV的LTR ,但在IFA中却不与REV的单抗反应。结果表明我国MD肿瘤中存在着REV的共感染 ,且我国MDV某些野毒株的基因组中有可能已经整合进了REV的LTR序列。

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒 (REV) SNV株的前病毒基因组 c DNA序列 ,设计并合成 1对引物 ,以 SNV株前病毒 c DNA全基因组克隆为模板 ,通过 PCR技术 ,扩增出该病毒囊膜糖蛋白 (env) gp90基因部分片段。将 PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进 p GEX- 5 X- 3载体中谷胱甘肽 - S-转移酶 (GST)的下游 ,将重组质粒转化进宿主菌BL2 1 中 ,在 1.0 mm ol/ L IPTG(37℃ )诱导下 ,gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,确定其表达的融合蛋白相对分子质量为 6 40 0 0。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠 ,所得的抗血清可与 REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)在免疫荧光试验中起反应。由此表明 ,体外表达的 SNV株gp90 - GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。

分子克隆化禽网状内皮组织增生症病毒传染性及其前病毒全基因组序列研究

利用脂质体转染技术,将含有SNV株禽网状内皮组织增生症病毒(REV)前病毒全基因组cDNA克隆质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。用对REV的单克隆抗体和抗REV env-gp90的鼠血清作间接免疫荧光反应,在原始的转染细胞及随后传代的细胞中均显示病毒特异性抗原。而且,在连续传代细胞中的阳性率明显升高。用REV特异性引物对进一步传代后的细胞基因组作PCR,也检测出REV基因组。这些结果均表明所得到的分子克隆化病毒具有传染性,因而也进一步证明所用的质粒克隆包含有具感染性的全病毒基因组。对该全基因组cDNA克隆进行酶切所获得的数个亚克隆进行测序,并将序列进行拼接,完成了REV全基因组序列。REV的这个传染性克隆将有助于进一步研究REV的分子生物学特性。

四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒感染情况调查

对四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒(REV)感染情况进行调查,为鸡群REV净化和防控提供依据。采用文献报道的PCR方法,分别对来自四川新津、温江、眉山、大邑、崇州和德阳等地6个肉种鸡群共160只外表健康鸡或生长发育不良、具有腺胃炎症状的鸡只样本进行PCR检测,同时将扩增片段克隆测序以确定其正确性。结果表明,6个鸡群REV群体阳性率均为100%(6/6),其中外表健康鸡REV检出率为65.8%(79/120),患腺胃炎病鸡REV检出率为82.5%(33/40);同一只鸡不同组织器官样本的检测结果显示,REV在骨髓和法氏囊中的检出率最高,分别为30%(36/120)和28.3%(34/120),提示骨髓和法氏囊是REV检测的主要靶器官;患腺胃炎鸡的腺胃中REV检出率达25%(10/40),而外表健康鸡腺胃样本REV阳性率仅0.8%(1/120),表明REV是导致鸡腺胃炎的重要病原之一。

含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片段的天然重组禽痘病毒的研究

将国内 5个不同生产厂家来源的禽痘弱毒疫苗株和 1株禽痘野毒株在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上连续传 5代 ,用禽网状内皮组织增生病病毒 (Reticuloendotheliosisvirus,REV)特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验 (Im munofluorescenceassay,IFA) ,均检测不到传染性REV。但以 6株禽痘病毒 (FPV)感染的第 2代和第 5代细胞基因组提取物为模板 ,通过PCR均能扩增出REV的长末端重复序列 (LTR)和囊膜蛋白 (env)基因片段。用特异性核酸探针作分子斑点杂交 (Dotblot) ,结果显示所扩增的PCR条带为特异的REV_LTR和REV_env基因片段。实验结果表明 ,国内的一些痘病毒疫苗和野毒株基因组中 ,已稳定地整合进了REV的基因组成分。

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法,其特异性和敏感性较好。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段。构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku。将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA)。经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%。该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。