鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据Gen Bank已发表NDV的F基因序列(Gen Bank登录号JX840454)和APV的F基因序列(Gene Bank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(La Sota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(Gen Bank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(Gen Bank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。

鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立

本研究建立三重RT-PCR快速检测鉴别鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV)和禽肺炎病毒(APV)的方法。根据Gen Bank中H9亚型AIV HA基因和鸡NDV以及APV F基因的保守序列分别设计合成了三对特异性扩增引物,通过优化反应条件建立了三重RT-PCR检测鉴别鸡NDV、H9亚型AIV和APV的方法。对该方法进行特异性、敏感性和临床样品检测。特异性试验结果显示,所有参试的NDV、H9亚型AIV、APV分别扩增出大小为247 bp、569 bp和424 bp的片段,而对照的其他毒株不扩增;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10 pg的各自RNA模板。检测临床样品132份,NDV阳性26份,H9亚型AIV阳性6份,APV阳性2份,结果与病毒分离结果一致。PCR阳性产物测序结果与各自毒株序列100%同源。表明本试验建立的三重RT-PCR检测鉴别鸡NDV、H9亚型AIV和APV方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于临床快速、准确的鉴别检测。

禽肺炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了一对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物,应用该引物建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行特异性、敏感性测定和临床样品检验。经检验该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,用该方法检测证实,采集的临床样品中还没有C亚型禽肺炎病毒的存在。

环介导等温可视扩增(LAMP)检测禽肺炎病毒方法的建立

建立一种快速简单检测禽肺炎病毒的方法。根据已发表的禽肺炎病毒的F基因序列,设计并合成6条特异扩增禽肺炎病毒F基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽肺炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的禽临床样品的DNA分别进行了检测。结果表明该法只检出禽肺炎病毒;敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽肺炎病毒为100fg的RNA模板。该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽肺炎病毒的快速检测。

Taqman探针荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒方法的建立

本试验旨在研究建立Taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒的方法。根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了1对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物和1条用荧光基团标记的Taqman探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料,与常规RT-PCR检测和病毒分离结果吻合。本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,该方法适合用于检测鸡中C亚型禽肺炎病毒的存在。

禽肺病毒研究进展

禽肺病毒（Avianpneumovims，APV）在上世纪70年代于南非首先分离到，随后研究证实APV存在A、B、C、D4个亚型。APV可以感染多种禽类，可导致感染动物鼻气管炎、肿头征、产蛋下降等疾病，给禽类养殖造成严重的危害。目前已经建立了一套成熟的APV检测系统，但由于APV在感染的宿主体内存活的时间很短，而且主要出现在疾病的早期，这给病毒的分离了很大的困难。目前，对APV致病机理和防制还缺乏足够的认识。因此，本文主要从APV病原学、病原检测和分离、致病机理、防控等方面的研究介绍目前对APV研究的进展。

一株禽多瘤病毒的分离鉴定及其VP1基因序列分析

从陕西某养鸟场发病鹦鹉幼雏体内分离到1株禽多瘤病毒(201808SX株),该病毒能在7日龄SPF鸡胚上繁殖,并呈现明显的胚体病变。通过克隆测序,获得了禽多瘤病毒(201808SX株)VP1基因全基因序列。同源性分析表明,201808SX分离株与不同地区不同时间APV分离株的VP1基因核苷酸同源性均较高,不低于99.4%,与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株和2018年中国C4-15分离株等同源性最高,均为100%。遗传进化分析表明,201808SX分离株在遗传进化上与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株、2018年中国C4-15株、2010年波兰分离株和2016年葡萄牙分离株处于同一小分支,均属于CladeⅡ分支。这是国内首次报道,将临床病料组织上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚成功地分离到APV,这为BFD的研究和防控奠定基础。试验结果也首次证实陕西地区虎皮鹦鹉中存在APV感染,丰富了国内APV流行的基础数据。

SARS病毒不同于禽冠状病毒

2003年5月香港发生了SARS(severe acute respiratory syndrome,严重急性呼吸道综合征),仅仅数周后有人推测SARS是由源于鸡的、类似于传染性支气管炎病毒(IBV)(图1)的一种冠状病毒所引起.无论如何,包括香港在内,是有过先例的:仅仅数年之前曾经发生过由鸡传染给人的疾病--流感,导致了一些人的死亡.那时,该病没有发展成一场大流行.那么,这次会不会呢?

甘肃省及周边局部地区猪禽病发生情况分析

1、猪禽病情况 2002年猪病发生的种类复杂,多达44种,发病猪群达502起,发病频率高、比较突出、比较严重以及新出现的或老病新颜的猪病统计也在10种以上.在猪病中猪瘟(含典型猪瘟、非典型猪瘟和繁殖障碍性猪瘟)仍居首位,占整个发病猪群的13.35%,仔猪黄白痢占7.57%,流行性腹泻占7.77%,猪传染性胸膜肺炎占6.57%,猪繁殖呼吸综合征占6.57%,猪链球菌病2.59%,猪伪狂犬病、猪气喘病、猪萎缩性鼻炎和猪脑炎各占5.18%,猪附红细胞体病3.38%,猪的"高温病"7.83%,仔猪断奶综合征3.23%,猪葡萄球菌病2.76%,疑似猪圆环病毒感染5.99%,猪"猝死症"0.92%,还有其它零星出现的猪病均占相当比例.

浅谈人感染H7N9禽流感病毒肺炎救治体会

自2013年3月,我国上海和安徽报告3例人感染H7N9禽流感病毒肺炎以来,截至2017年2月24日,中国向WHO报告的总发病例数为1 258例.确诊病例中,绝大多数有活禽接触史,重症肺炎ARDS常见,总体病死率高达41%[1].近几个月,我国11省出现散发病例,病例数与死亡人数明显增加.实际上已经开始经历H7N9禽流感第5个流行季.因此,呼吸与危重症同道必须密切关注疫情进展并指导当地患者救治.下面就H7N9人禽流感重症肺炎救治等问题谈谈经验教训.

鹅源禽痘病毒的鉴定和基因分析

2016年6月,广西邕宁某场有20%的阳江鹅在喙、眼和脚出现赘肉状痘癍,临床无死亡病例。为了研究此病的病原和基因特征,采集痘癍样本、制备病理组织切片进行显微镜观察、并利用透射电镜进行形态学分析以及TaqMan荧光定量PCR检测,证实其病原为禽痘病毒属(Avipoxvirus,APV)成员,命名为YNE。通过对病毒核芯蛋白P4b编码基因(fpv167)和DNA聚合酶Popr编码基因(fpv094)的部分序列串联进行比对,发现该毒株与1991年分离于北美林鸳鸯的APV高度同源,属于A5.2基因分支。进一步序列分析发现,该毒株与同期发生在该场的麻鸭源APV相应序列的同源性可达99.9%,初步证实该病毒可以在鸭鹅间跨种传播。

人高致病性禽流感一例并文献复习

目的提高临床医师对人禽流感的认识。方法分析辽宁省首例 H_5N_1型人禽流感患者的临床资料及文献复习。结果患者女性,31岁,来自辽宁省黑山县禽流感疫区,发病前与病死鸡有密切接触史,以“发热8 d,咳嗽、气短5 d,腹泻3 d”为主诉于2005年11月7日由黑山县医院转入中国医科大学附属第一医院发热门诊进行隔离治疗。患者入院时呈重症肺炎、呼吸衰竭的表现,入院后末梢血白细胞减少,细胞免疫功能低下,心肌受累,ALT 等多种酶学异常。经积极支持疗法、对症及抗病毒、抗感染治疗,患者病情逐渐好转,于2005年11月29日痊愈出院。该患者于出院后第9天(2005年12月8日)被确诊为 H_5N_1型人禽流感。结论本例高致病性人禽流感的成功救治是多学科密切协作的结果,与恰当的支持、对症治疗以及积极预防和及时处理并发症密不可分。