流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型(egg drop syndrome virus,EDSV)的荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法针对EDSV六邻体蛋白保守区分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的线性、特异性、精密性、灵敏度及可行性。采用新建立的荧光定量PCR法对16株流感疫苗主种子批毒种进行外源性EDSV检测。结果该方法的最佳线性范围为1×10~4~1×10~9 copies/μl,回归曲线为y=-3.385 x+39.616,R^2>0.99;与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应;试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均<2%;灵敏度为101 copies/μl;该方法检测P0代样品的最低检测限为10-6掺入体积比例,血清学方法检测P0~P3代样品的最低检测限为10^(-2)~10^(-3)掺入体积比例。该方法检测16株流感毒种中外源性EDSV的结果均为阴性,与血清学方法检测结果一致。结论成功建立了检测EDSV的荧光定量PCR法,提高了检测灵敏度和检测效率,更好地满足了流感疫苗应急检验中快检的要求。

鹅源腺病毒基因组E3区的鉴定和分析

在构建鹅源腺病毒Y81G4株Hind文库的基础上,通过特定的引物采用PCR方法从腺病毒文库的A片段中扩增并序列分析鉴定了腺病毒的E3区。E3区二端分别是保守性较强的pⅧ基因和纤维蛋白基因。和人腺病毒E3区相比,鹅源腺病毒E3区具有以下二个显著特征:(1)长度较短,全长仅为238个核苷酸;(2)E3区不具有明显的编码框。本研究也进一步证实了此鹅源腺病毒应归类于Ⅲ型禽腺病毒。