基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立

Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。

Ⅰ群4型禽腺病毒Y17215-1株体外增殖规律及免疫原性研究

为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性,本研究以LMH细胞为模型,摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间;通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡,测定其免疫原性。结果显示:Y17215-1株0.1 MOI接种LMH细胞,培养48~72 h病毒滴度达到峰值108.625 TCID_(50)/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性,LD_(50)为103.000 TCID_(50)/0.2 mL。以10^(7.676) TCID_(50)的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡,免疫后7 d 100%试验鸡产生中和抗体,14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(10^(7.676) TCID_(50)/羽),免疫后7 d 70%试验鸡产生中和抗体,21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD_(50)的Y17215-1株进行攻毒,活毒和灭活疫苗的保护率均为100%。以上结果表明:Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性,可以作为候选疫苗毒株。

血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

旨在从送检的病鸡中分离鉴定出禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),为临床诊断和疫病防控提供参考依据。本研究将阳性样品接种SPF鸡胚并传代,利用PCR检测、基因序列分析、动物回归试验等方法鉴定病毒。结果:经过鸡胚传代及病毒特异性检测获得了纯净的FAdV,命名为HB2306;分析Hexon基因序列可知,HB2306株属于血清4型分支,与国内外分离的FAdV-4毒株核苷酸序列同源性为98.2%~99.9%,HB2306株与国内外的4型高致病性毒株氨基酸序列相似性在97.9%~99.8%;受试动物临床病理变化显示,HB2306株以104.5EID50/只的剂量经胸部肌肉注射后,引起宿主心包积液,肝脏变黄肿胀、淤血出血,肾出血、肿胀等典型的病理变化,与流行的高致病性毒株所致临床症状相似,且死亡率为100%。综上,本研究成功分离并鉴定出一株FAdV-4高致病力毒株,丰富了毒种库,为该病毒感染的流行情况调查和综合防控奠定了基础。

一株鹅源禽腺病毒4型的分离及致病性

2023年,昆明一朗德鹅场部分雏鹅出现软脖子症状,伴有零星死亡,病变疑似禽心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)。本研究旨在对本次雏鹅病因进行分子病毒学诊断和病原的致病性研究。采集肝病料接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH):1)观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),取培养液负染、电镜观察病毒粒子形态;2)靶标4型禽腺病毒(serotype 4 fowl adenovirus,FAdV-4)的衣壳蛋白编码基因hexon基因进行PCR诊断,对扩增基因序列进行遗传演化分析;3)以5×10^(5.5)TCID_(50)/羽的剂量皮下注射感染10日龄健康泰州鹅,进行动物回归感染以确证其致病性。结果显示,将病料上清接种LMH细胞48~72 h后CPE明显,细胞圆缩、间隙变大、随后碎裂、逐渐脱落,电镜观察见二十面体无囊膜病毒粒子;PCR检测FAdV-4阳性,分离纯化病毒,命名为YNKM2023株;hexon基因的遗传演化分析显示,分离株与国内已有的鸡、鸭FAdV-4流行毒株相似性高达99.8%~99.9%,与印度分离株相似性为99.5%~99.6%。接种感染后,泰州鹅未出现典型的临床症状,但感染后3 d开始出现HPS的特征性病变,感染后6 d检测到中和抗体。综上,本研究成功分离到鹅源FAdV-4/YNKM2023株,该毒株与国内已有的鸡鸭流行毒株高度同源,尚未发生明显的基因漂移。分离株可以感染鹅,病毒可以在雏鹅体内复制引起组织器官病变并产生免疫应答,对鹅表现出一定的致病性,这有助于了解FAdV-4在鹅群的流行情况及其对雏鹅的致病性。

血清4型禽腺病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)进行快速检测的胶体金免疫层析法,将FAdV-4的hexon-L1蛋白进行原核表达,免疫兔制备多克隆抗体,将多抗包被在检测(T)线,将羊抗兔IgG包被在质控(C)线,用胶体金标记的多抗作为示踪剂,制备胶体金免疫层析检测卡,用于检测FAdV-4抗原,并对其敏感性和特异性进行评价,用其检测临床样本并与PCR检测结果相比较。结果显示,制备的胶体金检测卡可检出FAdV-4含量为10^(2.094)^(5)EID_(50),FAdV-8、新城疫病毒、禽白血病病毒等均不出现特异性条带,对临床样本的检测与PCR检测的符合率达98%。建立的胶体金检测方法可用于FAdV-4感染的快速检测。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

血清4型禽腺病毒Fiber蛋白的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立特异的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)血清学抗体检测技术,试验将FAdV-4纤突蛋白基因fiber-2克隆至载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-28a-Fiber-2,获得纯化的重组蛋白His-Fiber-2,以纯化的His-Fiber-2作为包被抗原建立检测Fiber-2抗体的间接ELISA方法,对该方法进行特异性、重复性、稳定性、灵敏性试验,并与BioChek FAdV商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较。结果显示:建立的ELISA仅与抗FAdV-4阳性鸡血清发生反应,与检测的抗其他病原的血清以及SPF鸡血清均无反应性,批间重复性与批内重复性良好,其变异系数分别在4.345%~6.983%和4.326%~9.391%之间,包被酶标板保存12个月后,变异系数为4.4%~10.0%,其检测灵敏度是间接免疫荧光检测技术的8~32倍,是基于包被GST-Fiber-2蛋白ELISA的2倍;建立的ELISA对FAdV-4灭活疫苗免疫的鸡血清检出率高于BioChek试剂盒,两者对临床感染FAdV-4的鸡血清的检测结果一致。研究表明,试验构建的基于重组蛋白His-Fiber-2的检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法为临床上FAdV-4感染监测以及疫苗的免疫评价提供了技术,具有良好的应用前景。

禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的转录组学功能分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引起禽肝炎-心包积液综合征的重要病原,严重危害我国养禽业的发展。研究表明,FAdV-4六邻体(Hexon)蛋白是决定病毒毒力和致病性的重要因素之一。为了进一步探究Hexon蛋白在FAdV-4感染中的重要作用,本试验以鸡肝癌细胞(LMH)为研究模型,利用转录组测序技术对外源表达Hexon所诱导的差异表达基因进行筛选。结果显示,与对照组相比,外源表达Hexon试验组共筛选到445个差异基因表达上调,36个差异基因表达下调。其中,BAG3、JUN、IL8L1、CCL4和THBS1等基因之前已被报道与FAdV-4感染相关,但HSPB9、HSP90AA1、HSPA8、HSPA2、DCN、ELOVL3和SBK2等基因在FAdV-4感染中的作用还未被揭示。GO富集分析结果显示,下调的差异基因主要与早期内体和蛋白酶体附属复合体相关,而上调的差异基因主要与质膜、细胞外表面区域和超分子纤维相关。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在MAPK、Wnt和VEGF等信号通路。此外,通过蛋白质相互作用网络分析发现,HSP90AA1、HSPA8、JUN和DCN等多个关键蛋白位于整个网络中心且已被报道与多种病毒复制密切相关。综上所述,本研究通过转录组测序筛选出一系列由外源表达Hexon诱导的差异表达基因,为控制FAdV-4感染提供了新的靶点和理论依据。

Ⅰ群4型禽腺病毒SDTC20株的分离鉴定与致病性研究

从山东郯城某疑似感染禽腺病毒(FAdV)的发病鸡群中采集病料并分离到1株FAdV,克隆纯化后进行PCR检测、酶切鉴定和序列分析,确定该毒株为血清4型禽腺病毒(FAdV-4),命名为SDTC20株。将该毒株接种LMH细胞增殖培养并建立了纯净稳定的种子批。为探究该毒株的致病性并确定该毒株的发病标准,对SPF鸡分别进行了不同接种途径、不同攻毒剂量、不同日龄以及对42日龄SPF鸡攻毒后发病规律观察的试验。根据试验结果确定血清SDTC20株的发病标准为:用7~56日龄SPF鸡10只,每只鸡肌肉注射稀释至含10^(5.0)TCID_(50)/0.1 mL的SDTC20株病毒液0.5 mL,观察7 d,攻毒鸡出现精神不振、羽毛粗乱、缩颈蹲伏等临床症状且剖检出现心包积液或肝脏肿大、出血、发黄等病理变化判为发病,攻毒鸡应至少90%发病且至少60%死亡。提示:SDTC20株可作为Ⅰ群FAdV-4相关生物制品有效性评价的标准强毒株,为后续产品研发奠定了毒株基础。

禽腺病毒4型Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白的单克隆抗体并建立Fiber-2蛋白的定量检测方法。本研究将原核表达的Fiber-2蛋白免疫BALB/c雌鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过免疫印迹、间接免疫荧光和抗体相加试验筛选杂交瘤细胞株;以制备的单克隆抗体为捕获抗体和酶标检测抗体,通过优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,建立特异性检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法。结果:本研究成功筛选到3株能够稳定传代的杂交瘤细胞株1H2、2A9和3E1,其分泌的抗体均与FAdV-4全病毒具有良好的反应性,可识别不同抗原表位;进一步发现,以1H2为捕获抗体、2A9为酶标检测抗体,能够建立检测Fiber-2蛋白的ELISA方法;该方法具有良好的重复性,批内重复及批间重复试验变异系数均小于10%;敏感性高,Fiber-2蛋白检测限为0.078 ng/μL;特异性好,不与FAdV-4的其他结构蛋白及鸭腺病毒3型的Fiber-2蛋白发生反应。综上,本研究成功制备了3株Fiber-2蛋白单克隆抗体,并建立了定量检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法,为后续FAdV-4基础研究和Fiber-2亚单位疫苗研究奠定了物质基础。

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

禽腺病毒4型GZ-B1毒株的Hexon基因序列分析

为了解禽腺病毒4型(FAdV-4)GZ-B1株的遗传进化情况,试验设计合成FAdV-4 Hexon基因的特异引物,对GZ-B1株Hexon基因进行PCR扩增并克隆至pMD-19T载体,基因测序和遗传进化分析。结果:扩增的Hexon基因长度为327 bp,与预期相符。GZ-B1株与国内外13株FAdV参考毒株中的7株FAdV-C毒株同源性较高(95.8%~98.5%),其中与国内强毒株GDMZ、LC1611、SDSG、SDXL同源性最高(均为98.5%),与基因型A、B、D、E的6株参考毒株同源性较低(73.0%~77.5%)。遗传进化树显示,GZ-B1株与基因型A、B、D、E毒株处于不同进化分支,与国内外C基因型毒株处于同一进化分支,表明该毒株与C基因型毒株遗传差异较小,其中与国内C型强毒株LC1611的遗传差异最小,亲缘关系最近。结论:FAdV-4 GZ-B1株属于C基因型、血清4型,与国内流行株FAdV-4 LC1611亲缘关系最近,同源性最高。

血清4型禽腺病毒的检测方法及疫苗研究进展

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)以感染3~6周龄的肉鸡为特征,主要引起心包液-肝炎综合征,其传播范围广,给养禽业造成的损失较大。禽腺病毒有12种血清型,因血清型众多,给血清4型禽腺病毒的诊断及防控带来一定的困难。本文对血清4型禽腺病毒的分子生物学检测方法(聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR和环介导等温扩增)、血清学检测方法及其他检测技术,以及灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗及生物制品的最新研究进展进行了综述,为血清4型禽腺病毒的检测和疫苗的研究提供参考。

1例疣鼻天鹅Ⅰ群禽腺病毒血清4型的诊断与治疗

为给临床兽医及科研工作者提供疣鼻天鹅禽腺病毒4型诊断与治疗的借鉴。方法:该文通过临床诊断、血清学检测、粪便检测、荧光PCR检测等手段对伊犁州林草局野生动物保护办公室发现的4只4月龄患病疣鼻天鹅进行诊断。结果:血清学检测结果显示天鹅血清样本中禽流感和新城疫抗体水平为0,荧光PCR检测结果显示4只疣鼻天鹅禽呼肠孤、鸭坦布苏均为阴性,禽腺病毒4型为阳性。结论:可判定该群疣鼻天鹅感染Ⅰ群禽腺病毒血清4型,通过使用腺病毒卵黄抗体并配合抗生素和对症治疗,4只天鹅5 d后均治愈,治愈率100%。

血清4型禽腺病毒感染LMH细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

【目的】了解鸡肝癌细胞(LMH)感染血清4型禽腺病毒(FAdV-4)后干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达量变化,为研究FAdV-4与ISGs的相互作用提供参考依据。【方法】试验将FAdV-4感染LMH细胞,观察不同时间点细胞病变,并收集感染0、12、24、36、48、60、72、84和96 h的细胞样品,通过实时荧光定量PCR技术检测感染病毒后不同时间点IFN-α和IFN-β及ISGs基因在转录水平上表达量的动态变化规律。【结果】LMH细胞感染FAdV-448 h时出现典型的细胞病变;在感染12 h后,FAdV-4快速增殖,60 h时达到峰值;感染病毒后各时间点,与对照组相比,IFN-α基因转录水平表达量均显著下调(P<0.05);与对照组相比,在感染后12和24 h,IFN-β基因表达量显著下调(P<0.05),在36 h时迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降且趋于稳定,但仍显著高于对照组(P<0.05);ISG 12、IFIT 5及DDIT 4基因在感染前期变化不大,在感染后36 h时迅速上调,在感染后96 h达到峰值(P<0.05);ZFP 313、IFITM 3及Viperin基因在感染前期表达量变化不大,随后在36 h迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降,但仍显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,CD 47、OAS和PKR基因均呈现下调表达。【结论】在FAdV-4感染LMH细胞后,IFN及多种ISGs在转录水平呈现规律性变化,与病毒在LMH细胞中复制存在一定的联系,表明这些天然免疫因子可能在抗FAdV-4反应中发挥着重要作用。

禽腺病毒血清4型感染的LMH细胞mRNA表达谱分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的禽肝炎-心包积液综合征已严重危害我国养禽业的发展,迫切需要深入了解FAdV-4的致病机制并制定有效的防控方案。论文旨在利用高通量测序技术分析禽腺病毒血清4型感染鸡肝癌(Leghorn male hepatocellular,LMH)细胞后差异表达的mRNA,以探究mRNA在FAdV-4感染过程中的作用及其调控机制。结果显示,与对照组相比,FAdV-4感染48 h共筛选到2604个上调的差异表达基因,2883个下调的差异表达基因。其中,GNB3、NECTIN4、SFRP4、FABP2、PLPP3、GALR1L和MBL 2等基因之前并没有被报道过与FAdV-4感染相关。通过GO和KEGG分析得知,差异表达基因主要富集在从细胞表面位点和信号受体结合至细胞周期调节、MAPK信号通路、细胞黏附分子作用等;其中,显著下调的差异基因还富集到多种代谢途径中,提示病毒感染会影响宿主细胞的代谢水平。本研究为深入解析FAdV-4感染宿主细胞的致病机制提供了相关的理论基础及科学依据。

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber1蛋白表达量更高,免疫后血清抗体效价更高,更具有制备多克隆抗体的优势。

4株禽腺病毒4型的分离及序列分析

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)是家禽常见的传染病病原之一,可引起鸡心包积液-肝炎综合征,死亡率为20%-80%,给家禽养殖业造成巨大的经济损失。该研究分离鉴定了分别来自广东省和云南省的4株FAdV-4,通过对FAdV-4主要结构蛋白Hexon基因和Fiber-2基因的全基因扩增及序列分析,结果显示,4株FAdV-4分离株(分别命名为JM、QY、FS和YN)Hexon基因和Fiber-2基因的核苷酸序列相似性均为100%。Hexon基因和Fiber-2基因系统进化树显示,本研究分离的4株FAdV-4均位于I群禽腺病毒的C种,属于禽腺病毒4型分支,与我国流行的FAdV-4亲缘关系较近。该研究为探究目前流行的FAdV遗传进化关系提供了参考。

禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(cGAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30453-30674 bp,第2个发生在36884-36988 bp,第3个发生在43401-43715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P<0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P<0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。

血清4型禽腺病毒Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于Taq Man探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Hexon基因序列,设计相关的qPCR特异性引物和探针,经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后,最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明,优化后标准曲线决定系数(R^(2))为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法,除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到,该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝,而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10000个拷贝,说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测,结果显示,qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PCR特异性引物检出的符合率为82.35%,表明该qPCR方法针对临床疑似样品的检测准确性更高。该方法的建立有助于推动禽腺病毒病的分子流行病学研究和防控。