湖南省部分地区禽致病性大肠杆菌分离鉴定及生物特性分析

为探究湖南省禽致病性大肠杆菌的生物特性,从部分地区规模肉鸡场采集122份病死鸡临床肝脏样品,采用传统细菌培养方法进行分离培养和初步鉴定,利用大肠杆菌持家基因phoA进行PCR扩增,对纯化鉴定后的分离株进行血清型鉴定、种系发育群检测、多位点序列分型(MLST)、毒力基因检测、动物致病性试验及耐药性分析。结果显示:共分离出83株禽致病性大肠杆菌,鉴定出15种血清型,其中O2、O1、O78、O14为优势血清型,种系发育群分为B2、B1、A和D群,高致病性株主要来自B2、B1群;MLST分析共得到12种ST型,其中ST95、ST481、ST350为主要ST型;分离株irp2、fyuA、iutA、fimC毒力基因携带率为100%,其中38.55%菌株同时携带irp2、afa、fyuA、iutA、hlyF、iss、papC、fimC毒力基因;雏鸡致病性试验检出高致病性菌株46株(55.42%)、中等致病性菌株31株(37.35%)、低等致病性菌株6株(7.23%);分离株对10种常用抗生素有不同程度耐药,其中对四环素和新生霉素耐药最严重,耐药率分别为96.38%和92.77%。结果表明,湖南省禽致病性大肠杆菌遗传关系整体复杂多态,且致病性较高,耐药广泛,提示该地区应加强对禽大肠杆菌病的防控。

禽致病性大肠杆菌HlyE蛋白的免疫原性研究

为评估禽致病性大肠杆菌(APEC)溶血素HlyE蛋白的免疫原性,本研究对APEC溶血素HlyE蛋白进行原核表达和纯化,并对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析,将纯化蛋白利用透析袋在4℃透析后,利用血琼脂平板对其溶血活性进行检测。SDS-PAGE和western blot结果显示,表达并纯化到分子量约为36 ku的重组HlyE蛋白(rHlyE),经ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定纯化后蛋白浓度为0.65 mg/mL;溶血活性检测结果显示,rHlyE具有溶血活性。以透析后的rHlyE作为抗原,按照50μg/只的剂量免疫小鼠,对照组于相同时间点注射等量PBS,共免疫3次间隔14 d,并于首免后不同时间采血,采用间接ELISA方法检测两组小鼠血清特异性抗体水平,并于三免后18 d以2 LD_(50)的APEC菌液攻毒小鼠,观察7 d内小鼠的死亡情况;于首免后28 d剖杀各组小鼠取其脾脏制备脾淋巴细胞,采用流式细胞术分别检测CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率,对rHlyE的免疫原性进行评估。间接ELISA检测结果显示,该蛋白能够诱导机体产生体液免疫应答,分泌高表达量的IgG抗体,抗体水平于三免后15 d达到最高水平。rHlyE免疫攻毒保护试验结果显示,免疫组小鼠基本无明显临床症状,7 d内存活率达80%;而对照组小鼠表现明显临床症状,于攻毒后3 d内全部死亡。流式细胞术结果显示,与对照组相比,免疫组小鼠的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率均升高。上述结果表明,rHlyE在大肠杆菌BL21中为部分可溶性表达,将其免疫小鼠后可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫应答,并且可对小鼠产生较好的免疫保护效果。本研究明确了APEC HlyE蛋白的免疫原性,为APEC免疫保护蛋白的筛选以及疫苗研发提供了借鉴与参考。

39味中药及其复方对鸡源禽致病性大肠杆菌体外抑菌试验研究

试验旨在筛选抑制鸡源禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)O78地方流行株的有效中药。采用打孔法测定39味中药及其复方对APEC的抑菌效果,使用二倍稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:39味中药中有9味中药对APEC有一定的抑菌效果,其中五味子、洛神花和黄柏对APEC高度敏感,MIC依次为31.25、31.25、500 mg/mL,MBC依次为62.5、125、500 mg/mL;蒲公英、红花和石榴皮中度敏感,MIC与MBC均大于或等于500 mg/mL;丹皮、何首乌和荷叶低度敏感;其余中药无抑菌效果。复方中五味子+洛神花配伍药效最好,MIC与MBC分别为31.25 mg/mL与125 mg/mL。说明在39味中药中五味子、黄柏、洛神花和复方五味子+洛神花(1∶1)对APEC有比较好的体外抑菌能力。

双组份系统调控禽致病性大肠杆菌生物被膜的研究进展

禽致病性大肠杆菌是一种典型的肠道外致病性大肠杆菌,能够引起各种肠道外疾病,给禽类养殖业造成重大的经济损失。生物被膜作为一种保护细菌的物理屏障用于抵御抗生素的损伤及逃避宿主的免疫系统,从而导致宿主持续和反复性感染。双组份系统是普遍存在于各类细菌中主要的信号传导系统,参与调控细菌抗生素耐药性和生物被膜的形成。为了解由生物被膜造成的禽致病性大肠杆菌感染机制,文章详述了生物被膜的形成过程,并综述了双组份系统调控生物被膜形成的分子机制,以期探寻阻断双组份系统信号转导的新方法以破坏生物被膜的形成作为控制禽致病性大肠杆菌感染的治疗策略,从而为防治由生物被膜引起的抗生素耐药性以及持续或反复性感染提供研究方向。

蛋鸡禽致病性大肠杆菌分离鉴定及噬菌体制剂体外杀菌研究

为研究噬菌体制剂对蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗效果,从某蛋鸡养殖场采集疑似禽致病性大肠杆菌感染的病料,进行病原的分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等操作,选择其中代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验。结果可见有深紫黑色且带金属光泽细菌生长;镜检可见呈红色两端钝圆的短杆菌;生化鉴定,符合大肠杆菌的生化特性;PCR检测和序列分析结果表明为大肠杆菌。累计从152份样品中分离到大肠杆菌49株,药敏试验结果显示49株分离菌对环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等耐药率分别高达89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,临床耐药情况严重。选用5株代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验,与氟苯尼考相比,噬菌体制剂体外杀菌效果更优。复合噬菌体制剂可用于蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。

一例禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药分析

为了探明河南地区白羽肉鸡养殖场肉鸡大量发病死亡原因,采用细菌平板划线法对病鸡病料进行细菌分离纯化,经LB琼脂平板与伊红美蓝鉴别性琼脂平板划线培养,得到形状均匀、大小一致的菌落。PCR与生化试验鉴定结果显示,该菌株为禽致病性大肠杆菌。采用药敏纸片法试验测定常见抗生素药物敏感性,结果显示该菌株对氨苄西林、阿莫西林、土霉素、哌拉西林、四环素、庆大霉素耐药,对恩诺沙星、氟苯尼考、阿米卡星和新霉素敏感,对左氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素和金霉素中等耐药。

江苏省部分地区水禽肠道外致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究旨在明确江苏地区水禽致病性大肠杆菌的血清型、进化分群、毒力基因分布和耐药情况,以期为水禽大肠杆菌病的防控提供依据。本研究从江苏省部分规模化水禽养殖场疑似大肠杆菌感染病例中,分离得到24株水禽肠道外致病性大肠杆菌,并检测分离菌株的血清型、毒力基因分布、系统进化分群和耐药情况。血清型检测结果表明,O65血清型菌株共8株,占全部菌株的33.3%,O16、O68、O87、O126、O138、O164血清型菌株各1株,其他未鉴定血清型10株;毒力基因检测结果表明,fimA、ECs3737、ECs3703、tsh和irp2基因在分离菌株中的阳性率分别为83.3%、75.0%、66.7%、33.3%和4.2%,其中含有4个毒力基因组合的菌株占29.2%;系统进化分群结果表明,非致病群A占45.8%,低致病群B1占33.3%,高致病群B2和D分别占8.3%、1.3%;药敏试验结果表明,24株分离菌株均对恩诺沙星、强力霉素100%耐药,对四环素、万古霉素、红霉素的耐药率为91.7%,对阿莫西林/棒酸的敏感率为100%。本研究结果表明,江苏省水禽致病性大肠杆菌血清型较为复杂、耐药性严重。

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响,试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株,通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响,并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示:APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异,但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株;TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(103.328),显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05);此外,TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01),而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明:tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS),并均经PCR及测序鉴定,结果显示,gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线,利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性;利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性;利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示,3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI),分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力,并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示,WT与KO菌株的体外CI为0.32,表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示,相对于WT、RS菌株,KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<0.001),且KO菌株BF的主要组成成分curli菌毛有明显变化,表明gltS基因参与APEC BF中curli菌毛的形成,而3株菌在含荧光增白剂琼脂板的荧光强度均一致,表明gltS基因与APEC BF中纤维素的形成无关。采用细菌计数法统计WT、KO、RS菌株在6种应激条件下的生存率,结果显示,除氧化应激条件下3株菌的生存率无显著差异外,在酸、碱、热、铁饥饿应激环境中,与WT和RS菌株相比,KO菌株的生存率均极显著降低(P<0.001、P<0.0001)。在50 mg/L、100 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率显著降低(P<0.01);在150 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率极显著降低(P<0.001)。采用菌落计数法测定WT和KO菌株抗不同浓度血清的杀菌作用,结果显示,在高浓度的血清中(50%~100%),WT、KO菌的数量显著高于DH5α对照菌株(P<0.05);但在不同浓度血清中KO菌的数量与WT菌的数量差异不显著。本研究结果首次证实gltS基因参与APEC部分生物学特性的形成,为进一步阐释gltS基因功能及该菌的致病机制奠定了基础。

禽致病性大肠杆菌病疫苗研究进展

禽致病性大肠杆菌病是一类由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的、严重危害家禽养殖业的禽类重要疾病。APEC血清型众多,容易产生耐药性并且还具备感染人的潜力,对公共卫生安全造成严重影响。疫苗接种能针对APEC产生较高保护效力,从而减少禽养殖业经济损失。禽致病性大肠杆菌病疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等。文章综述了禽致病性大肠杆菌病及其疫苗的研究进展,旨在为禽致病性大肠杆菌病的防控和疫苗的研发应用提供一定的理论参考。

禽致病性大肠杆菌黏附素疫苗研究进展

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是导致不同日龄禽类局部和全身感染的重要病原菌,也是人肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)毒力基因的重要贮存库或来源。随着APEC耐药菌株的日益增多,迫切需要开辟防控APEC感染的有效途径,其中阻止细菌感染的初始阶段便是防控感染的最有效措施之一。黏附素除介导细菌与宿主组织结合外,也是成功建立初始感染的第一步。因此,利用黏附素作为靶标制备疫苗预防APEC感染将是一种极有前途的策略。笔者重点介绍了菌毛黏附素、非菌毛黏附素和非典型黏附素等的结构与功能,以及有望成为APEC候选疫苗的黏附素的应用潜力和最新研究进展,如1型菌毛、P菌毛、普通菌毛、Yqi菌毛、Stg菌毛、Curli菌毛、温度敏感血凝素(Tsh)、AatA、FdeC、YeeJ、鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白A等。黏附素疫苗一旦开发成功,将有望成为一种防控APEC感染的有力手段。

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响,采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线,并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小,野生株、缺失株和回补株均无溶血活性,证明HlyE-V不是孔道形成毒素,不能溶解哺乳动物的红细胞;HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低,缺失株的半数致死量(LD50)值为4.9×10^(6)CFU/只,而野生株和回补株的LD50分别为8.2×10^(5)CFU/只、4.2×10^(5)CFU/只;在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降,在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6~8个细菌,且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌;而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时,菌量超过6个的仅为10.7%,相较野生株下降了46%。研究表明,HlyE-V对APEC的致病力起着关键作用。

禽致病性大肠杆菌fdtACB基因缺失株的生物学特性研究

为研究O抗原侧链岩藻糖合成酶基因fdtACB对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究以O_(2)血清型APEC DE17为亲本株,通过Red同源重组构建fdtACB基因缺失株与回补株,经PCR及测序鉴定确认缺失株ΔfdtACB和回补株CΔfdtACB均正确构建。采用硝酸银染色法鉴定细菌脂多糖(LPS)图谱,采用western blot鉴定缺失株与O_(2)血清型O因子血清的反应性。硝酸银染色法结果显示,ΔfdtACB缺失株未产生与野生株一样完整的LPS图谱,表现为部分O抗原梯状条带缺失和移位;western blot结果显示,ΔfdtACB与大肠杆菌O_(2)血清型O因子血清无反应条带。各菌株培养16 h后每隔1 h测定OD600nm值,绘制生长曲线;于半固体培养基培养各菌株,通过测量细菌运动圈直径分析各菌株的运动能力,通过结晶紫染色法检测各菌株生物被膜(BF)形成能力,结果显示,ΔfdtACB缺失株、野生株和回补株间生长速率无明显差异(P>0.05);与野生株相比,ΔfdtACB缺失株的运动能力显著降低(P<0.01),BF形成能力显著升高(P<0.01)。以上结果表明fdtACB影响细菌O抗原完整性、运动及BF的形成。将各菌株分别感染DF-1细胞后通过细菌计数分析APEC对细胞的黏附及侵袭力,结果显示,ΔfdtACB对DF-1细胞的黏附及侵袭力均较野生株极显著降低(P<0.01)。以不同浓度各菌株腹腔注射感染大蜡螟后,根据5 d内各组大蜡螟死亡数量计算各菌株LD50,结果显示,除高剂量各菌株外,其它剂量各菌株注射后,ΔfdtACB组大蜡螟死亡数较其它组少,经计算野生株LD50为1.85×10^(2) cfu/mL,缺失株LD50为9.16×10^(2) cfu/mL,回补株LD50为8.0×10^(1) cfu/mL,缺失株致病力比野生株降低约5倍,表明fdtACB影响细菌感染性和致病力。综上所述,本研究首次证实大肠杆菌岩藻糖合成酶FdtACB参与O_(2)型APEC O的抗原合成,在细菌运动、BF形成和感染过程中发挥作用,该结果对掌握APEC O抗原侧链的生物学功能具有重要意义。

四味穿心莲散水煎剂防治禽致病性大肠杆菌病疗效研究

为考察四味穿心莲散水煎剂(DSCS)对禽致病性大肠杆菌(APEC)的抗菌活性,本试验用微孔-平板法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);用10日龄雏鸡制备APEC感染模型,随机分为5组,每组20只,设DSCS高、中、低三个剂量组,氟苯尼考阳性对照组和感染组,另设一组健康对照组,口服给药,连用5 d,观察疗效。结果显示:DSCS对APEC的MIC为7.82 mg/mL,MBC为31.25 mg/mL;DSCS组对APEC病的治愈率为50%~82%,与氟苯尼考组相当,DSCS高剂量组有效率显著高于氟苯尼考组(P <0.05)。由此表明,四味穿心莲散水煎剂能够有效治疗APEC病。

禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失对雏鸡气管黏膜细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的影响

为探究clpV基因在禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)感染雏鸡气管黏膜过程中发挥的作用及机制。将APEC野生株(DE17)及其基因缺失株(DE17ΔclpV)感染7日龄雏鸡气管,12、24h后收集雏鸡气管黏膜细胞进行转录组学测序,筛选野生株和缺失株的差异表达基因,进行GO和KEGG富集分析。结果显示,在感染12 h后,共筛选到108个差异表达基因(36个上调,72个下调);在感染24 h后,共筛选到59个差异表达基因(34个上调,25个下调)。GO分析表明,差异表达基因主要富集在细胞内信号转导、RNA聚合酶Ⅱ的转录正调控等生物学过程;蛋白质结合、ATP合成、DNA结合等分子功能类;生物膜及膜的组成成分、细胞质等细胞组分功能;KEGG分析表明,差异表达基因主要富集在紧密连接通路、内质网中的蛋白质加工通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、内吞通路、Wnt信号通路等。结论为clpV基因缺失后,会使部分差异表达基因的表达量下调,对细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路产生影响。

禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为1038和4700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为65 ku的蛋白条带,表明成功转染pEGFP-N1-ompA至DF-1细胞中并大量表达ompA-EGFP融合蛋白。同时Western blotting结果显示,过表达OmpA可引起自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达量增加;通过透射电子显微镜可观察到DF-1细胞中的自噬小体。将单荧光GFP-LC3质粒转染DF-1细胞,OmpA蛋白处理组呈现绿色荧光点的聚集,说明OmpA引发DF-1细胞自噬。进一步研究发现,OmpA影响自噬标志蛋白p62降解,转染双荧光mRFP-GFP-LC3质粒检测显示OmpA可阻断自噬流的发生。【结论】APEC外膜蛋白OmpA可引起DF-1细胞发生自噬,但其抑制自噬流的发生,引发DF-1细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。

桂皮醛对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成影响的研究

为探究桂皮醛对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物被膜(BF)的形成及其相关基因转录水平的影响,本研究利用牛津杯法分别检测桂皮醛对3株BF强阳性(E-39、E-40、E-41)和3株中等阳性(E-27、E-30、E-42)APEC的抑菌圈,分析桂皮醛对APEC的抑菌活性;采用二倍稀释法测定桂皮醛对上述6株APEC的最小抑菌浓度(MIC);根据该结果,进一步采用96孔板结晶紫染色法测定MIC、1/2 MIC和1/4 MIC桂皮醛对6株APEC BF形成能力的抑制作用;采用qPCR法分别检测1/2 MIC和1/4 MIC桂皮醛对6株APEC BF形成相关基因转录水平的影响。结果显示:桂皮醛对6株APEC的抑菌圈直径为16.12±0.13 mm~23.80±0.23 mm;桂皮醛对BF强阳性和中等阳性APEC菌株的MIC均为256μg/mL;BF形成能力的检测结果显示,与未用桂皮醛处理的APEC相比,MIC、1/2 MIC和1/4 MIC的桂皮醛均极显著抑制上述6株APEC BF的形成(P<0.01),且该抑制作用与桂皮醛的浓度呈正相关;经1/2 MIC和1/4 MIC桂皮醛处理3 d后,与未经桂皮醛处理的APEC阳性对照组相比,3株BF强阳性菌株组氨酸激基因qseC、鞭毛主调节器基因flhC和外膜外排蛋白基因tolC的转录水平均显著降低(P<0.05),代谢基因bdcR的转录水平均显著升高(P<0.05),3株BF中等阳性菌株反应调控蛋白基因qseB、qseC及flhD、flhC和tolC基因的转录水平均显著降低(P<0.05)。本研究首次证实桂皮醛在体外对APEC有较强的抑菌活性,并且可通过影响APEC qseB、qseC、flhD、flhC、tolC和bdcR基因的转录水平进而抑制其BF的形成。本研究为临床防治大肠杆菌病及清除其BF提供了参考依据。

中西药联用对禽致病性大肠杆菌病的治疗作用

试验旨在研究中药有效成分组合物联用西药对禽致病性大肠杆菌病的治疗效果。试验采用O78致病性大肠杆菌建立蛋雏鸡人工感染模型,利用中药组合物+头孢噻肟治疗患病鸡群,以治愈率、死亡率等综合评价组合物的治疗效果。结果显示,小檗碱、柠檬酸、芦丁对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为2.00、6.25、8.00 g/L;O78大肠杆菌的最佳攻毒剂量为1.102×10^(8) CFU/mL;动物回归试验结果提示禽致病性大肠杆菌病模型建立成功;中药组合物和头孢噻肟联用对大肠杆菌病的治愈率达86.7%,有效率为93.3%,死亡率为6.7%。研究表明,由柠檬酸、芦丁、小檗碱组成的中药组合物可增强大肠杆菌对头孢噻肟敏感性,试验结果为减少抗生素使用剂量和耐药菌感染的防控提供了参考。

传染性法氏囊病病毒和禽致病性大肠杆菌的二重探针实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立用于传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽致病性大肠杆菌混合感染快速鉴别检测的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,研究分别根据IBDV VP2基因和大肠杆菌UidA基因设计合成特异性引物和探针,通过普通PCR方法扩增目的基因片段并克隆至pGM-T载体,构建重组质粒pGM-T/VP2和pGM-T/UidA作为标准品,通过正交试验确定引物和探针的最佳浓度,分别建立基于VP2和UidA基因的标准扩增曲线,并进一步验证其特异性、灵敏性、重复性,建立的方法应用于人工感染样本和临床样本的检测,并与常规PCR方法进行比较。结果显示:VP2和UidA基因的最佳上、下游引物浓度均为0.30μmol/L,VP2和UidA基因的探针浓度分别为0.35μmol/L和0.25μmol/L;VP2和UidA基因扩增的线性范围均为10^(3)~10^(7)拷贝/μL,相关系数R2≥0.99,灵敏度均为100拷贝/μL;两者组间及组内变异系数均小于2%;人工感染样品与临床样品的检测结果与普通PCR方法一致。研究表明,建立的二重探针FQ-PCR方法为同时检测IBDV和禽致病性大肠杆菌提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。

hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(fimF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。