番木瓜CpTIFY10A-like基因克隆及表达分析

【目的】克隆番木瓜CpTIFY10A-like基因序列,并分析其表达特性,为探索该基因功能和抗番木瓜环斑病毒(PRSV)分子机制提供理论依据。【方法】结合前期研究的抗PRSV转录组数据,利用RACE对上调表达基因Cp-TIFY10A-like进行克隆,获得该基因cDNA全长序列,分析其编码区序列(CDS)及进行生物信息学分析。利用已鉴定的PRSV对3月龄番木瓜植株进行不同处理,以感染PRSV且出现病症的植株(CK+)、1.0 mL/L禾甲安(CTS-N)灌施感染PRSV且出现病症的植株(B)为处理组,以清水灌施(不添加禾甲安)不感染PRSV的植株(CK-)为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同处理下PRSV基因和CpTIFY10A-like基因在番木瓜叶片中的表达情况。最后将CpTIFY10A-like基因CDS序列连接至pET28a-sumo载体上构建原核表达载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,通过不同浓度IPTG诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测原核表达情况。【结果】CpTIFY10A-like基因全长为1352 bp,CDS序列为822 bp,编码273个氨基酸残基;其编码蛋白理论等电点(pI)9.23,不稳定系数62.97,亲水性平均系数-0.458,属于不稳定的亲水性碱性蛋白,定位在细胞核上,其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,同时含有少量的β-折叠和延伸链。CpTIFY10A-like蛋白与酸枣和白梨TIFY蛋白的氨基酸序列相似性较高,均含有特定的TIFY结构域,属于TIFY蛋白家族,三者在系统发育进化树上聚在同一分支,表明亲缘关系较近。不同处理的番木瓜叶片中,PRSV基因的相对表达量排序为CK+(1.02)>B(0.39)>CK-(0),CpTIFY10A-like基因的相对表达量排序为B(53.12)>CK+(1.15)>CK-(1.02),且CpTIFY10A-like基因在经禾甲安处理的感染PRSV番木瓜叶片中相对表达量显著升高(P<0.05,下同),而PRSV基因的相对表达量显著降低。CpTIFY10A-like基因在原核细胞中表达蛋白的分子量与理论分子量(29.36 kD)相符,且不同浓度IPTG诱导下,IPTG浓度越高,蛋白表达量越多,表明该基因在原核细胞中成功表达。【结论】禾甲安可诱导CpTIFY10A-like基因高效表达,进而通过茉莉酸通路起调节作用以抵抗PRSV感染,即CpTIFY10A-like基因在番木瓜抗PRSV过程中发挥重要调控作用。