琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对禾谷丝核菌的抑制活性及结合模式

主要由禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis引起的小麦纹枯病是一种土传真菌病害,自20世纪90年代中期以来,黄淮麦区小麦纹枯病逐渐由次要病害上升为主要病害,对常见的杀菌剂类型已经出现了抗性菌株。新商品化的琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)杀菌剂对禾谷丝核菌的抑制活性尚未见报道。本研究选取3株禾谷丝核菌ZMDBY-9、JZWZ-8和ZMDBY-6,采用菌丝生长速率法测定了10种SDHIs类杀菌剂萎锈灵、氟酰胺、噻呋酰胺、啶酰菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、氟吡菌酰胺、氟吡菌酰羟胺和联苯吡嗪菌胺对禾谷丝核菌的抑制活性;采用同源模建及分子对接,研究了RcSDH bcd构成的蛋白模型与10种SDHIs类杀菌剂的结合模式,进一步分析了结合能与抑菌效果的关联性。菌丝生长速率法测定结果显示:苯并烯氟菌唑和氟唑菌酰胺对禾谷丝核菌的抑制活性较高,平均有效抑制中浓度(EC50)值小于0.1 mg/L;氟吡菌酰胺与氟唑菌酰羟胺的抑制活性较弱,平均EC50值大于1 mg/L;其他6种杀菌剂的平均EC50值为0.1~0.6 mg/L。分子对接结果显示:在10种SDHIs类杀菌剂中,含吡唑-4-酰胺结构的药剂对禾谷丝核菌的抑制活性最好,结合能更低。其中7种杀菌剂分子的抑制活性与结合能之间存在一定的关联性,表现为抑制活性强结合能往往较低。本文研究结果为SDHIs类杀菌剂在小麦纹枯病化学防治中的应用及基于琥珀酸脱氢酶的药剂设计提供了参考。

抗戊唑醇禾谷丝核菌的渗透压敏感性及相对渗率变化研究

经药剂筛选和UV诱导,分别获得了抗戊唑醇的禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌株,比较了其与敏感菌株对渗透压的敏感性和经不同浓度戊唑醇处理后的相对渗率变化。在相同的渗透压环境下,敏感菌株对渗透压较抗性菌株更为敏感。不同抗性菌株间对渗透压的敏感性在低渗和中渗环境下差异不大,在高渗环境下有一定的差异;而敏感菌株只对低渗透压(1%葡萄糖)和高渗透压(8%葡萄糖)相对较为敏感。用不同浓度的戊唑醇处理后,与敏感菌株相比,抗性菌株能在较短的时间里(1h)渗出更多的电解质,但最终前者的相对渗率要明显高于后者。用高浓度的戊唑醇处理抗性菌株后,其相对渗率明显高于低浓度处理。

禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性风险预测

采用菌丝生长速率法,测定了4个麦区的5个禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌株对井冈霉素的抗药性;在含井冈霉素的PDA平板培养基上对禾谷丝核菌进行继代培养,以诱导抗药性菌系;测定了抗性菌系对其他杀菌剂的交互抗性,并比较了抗性和敏感菌系对渗透压的敏感性及药剂处理后两种菌系培养液内还原糖和可溶性蛋白的含量差异。结果表明,田间禾谷丝核菌菌株对井冈霉素分别产生了7.26、7.75、10.46、14.92和23.31倍的抗性。室内继代培养36代,禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性达49.24倍,形成了抗井冈霉素菌系。抗井冈霉素菌系对口恶醚唑、福美双、三唑酮、丙环唑、戊唑醇和咯菌腈分别产生了48.58、21.78、17.62、10.95、2.55和1.78倍的交互抗性。抗性菌系在较低和较高渗透压下其生长抑制率均大于敏感菌系,用井冈霉素处理抗性和敏感菌系后,其体内的电解质都严重外渗,且抗性菌系在10h内的外渗量明显大于敏感菌系。

反相高效液相色谱法分析禾谷丝核菌菌丝中麦角甾醇和羊毛甾醇的含量

采用反相高效液相色谱法,建立了检测禾谷丝核菌中麦角甾醇和羊毛甾醇含量的方法。样品经过破碎、离心、皂化后定量测定。采用DiamonsilTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d,5μm i.d.),流动相为100%甲醇,流速为1 mL/min,紫外检测波长为210 nm,保留时间定性,外标法定量。麦角甾醇和羊毛甾醇的保留时间分别为21 min和27min。麦角甾醇在0.125-12.5 mg/L、羊毛甾醇在0.1-10.0 mg/L范围内,两者峰面积与浓度均呈线性关系,相关系数分别为0.9993和0.9983。添加回收率实验表明,2种甾醇的平均添加回收率为91.8%-99.7%;相对标准偏差为2.8%-7.8%;麦角甾醇和羊毛甾醇的最小检出量分别为1.0和0.8 ng,最低检出浓度分别为0.05和0.04 mg/L。本方法准确、简便、重现性好。

禾谷丝核菌胞外产物对小麦抗病性的诱导作用

测定了禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)的3个菌株R2、R7和R46的胞外多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,比较了经3个菌株的胞外产物处理48h后,3个抗性不同的小麦品种茎组织内苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(PO)的活性。结果表明,致病力强的R46和R7菌株的PG活性强,致病力弱的R2菌株的PG活性弱。3个菌株的胞外产物处理后,小麦茎组织内PAL和PO活性都表现增强,致病力强的R7和R46菌株的胞外产物对小麦组织内的PAL、PO活性诱导能力较强,在抗性品种上的表现更为明显,如抗病品种"陕229"经处理后,茎组织内PAL和PO活性增幅高于感病品种"苏麦3号"和"宁麦6号"。高温处理后,胞外产物对不同品种茎组织的PAL、PO活性影响不一致,致病力弱的R2菌株胞外产物,对小麦组织内PAL和PO活性的诱导作用高于致病力强的菌株R7和R46。

井冈霉素与其他几种杀菌剂混配对禾谷丝核菌的室内毒力

依据D-饱和最优回归设计原理,设计了20%井冈霉素可湿性粉剂分别与12.5%烯唑醇可湿性粉剂、80%乙蒜素乳油、80%代森锰锌可湿性粉剂、50%腐霉利可湿性粉剂、15%三唑酮可湿性粉剂、25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂的不同混配浓度,采用菌落生长速率法,测定各种药剂混配后对小麦纹枯病主要病原菌——禾谷丝核菌的毒力效果。结果显示:20%井冈霉素+12.5%烯唑醇对禾谷丝核菌的抑制效果最好,其最佳配比为20%井冈霉素0.030 g/L+12.5%烯唑醇0.019 g/L,理论最大抑制率得96.78%。单因素效应中:12.5%烯唑醇0.025 g/L,理论抑制率可达80.10%,为最高抑制水平;互作效应显示:20%井冈霉素0.035 g/L+12.5%烯唑醇0.017 g/L,理论抑制率达96.39%。

禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究

利用从小麦茎叶组织中分离的内生真菌,进行平板对峙试验,从中筛选出2株对禾谷丝核菌有明显抑制效果的菌株(RF5和RF6)。采用改良的真菌基因组DNA提取方法,提取内生真菌RF5和RF6的基因组DNA,运用ITS序列通用引物(ITS4、ITS5)进行扩增,分别得到约600 bp的特异条带。对PCR产物进行测序,根据序列比对分析结果,将拮抗真菌RF5和RF6分别鉴定为:肉座菌(Hypoc-reales sp.)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。进一步研究这2株拮抗真菌的抗菌活性大小,结果显示,2株真菌对病原菌都能产生明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为23 mm和19 mm;其液体发酵产物对病原菌的生长也有显著抑制作用,抑制率分别为63.3%和60.8%。

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)原生质体制备与再生的研究

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6d的菌丝,采用15mg/mL溶壁酶+10mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30℃下酶解4h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。

磷对禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)菌核形成的影响

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)是小麦纹枯病的主要致病菌,不同碳源和氮源对该菌菌丝生长的影响已有报道,而有关该菌菌核形成对营养物质的需求研究很少,本文报道了R. cerealis菌核形成与磷素的关系。 试验中所用菌株均分离自江苏各地小麦纹枯病株,属R. cerealis的CAG_1群菌株。 菌株保存和预培养,均用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA);Hopkins培养基作基础培养基研究磷素与R.

禾谷丝核菌的次生代谢产物

禾谷丝核菌 (RhizoctoniacerealisVanderHoeven)菌株对小麦的致病性测定结果表明 ,3个菌株的致病力存在显著差异。小麦品种和禾谷丝核菌菌株间存在显著的相互作用 ,在两个感病品种“苏麦 3号”、“宁麦 6号”和R7、R4 6 两个强致病力菌株间 ,这种相互作用尤为明显。禾谷丝核菌在马铃薯蔗糖培养液中产生的次生代谢物种类多 ,产量高。试验明确了进行禾谷丝核菌次生代谢物分析的最佳液相色谱条件。液相色谱和气质联用的结果显示 ,致病力不同的 3个菌株间 ,次生代谢物的构成上有差异 ,呋喃甲酸和苯甲酸衍生物的产量在菌株间差异最大。禾谷丝核菌的酸性粗提物具一定的生物活性 ,在高浓度和低浓度下的作用相反。禾谷丝核菌的次生代谢物处理后 ,小麦组织的电导率与对照 (未处理 )没有差异 。

牡丹丹皮酚对禾谷丝核菌菌丝体超微结构与主要成分含量的影响

为了揭示丹皮酚的抗菌机理,试验采用扫描电镜和透射电镜,研究了丹皮酚对禾谷丝核菌菌丝形态和超微结构的影响,采用分光光度法测定了丹皮酚对禾谷丝核菌菌丝体可溶性蛋白、还原糖、几丁糖含量的影响。结果表明,丹皮酚处理12 h后,菌丝顶端不规则膨大,分枝肿大或顶端缢缩,24 h后,菌丝顶端、分枝顶端或整个菌丝塌陷。菌丝细胞超微结构的变化包括细胞膜内突,细胞壁不规则加厚,加厚部位出现不明内含物,细胞内线粒体、液泡和脂肪粒等细胞器紊乱,在坏死的菌丝细胞中形成子菌丝。丹皮酚使禾谷丝核菌菌体可溶性蛋白与还原糖含量显著降低,且含量水平与处理浓度呈负相关;丹皮酚使菌体几丁糖含量显著升高,且含量水平与处理浓度呈正相关。

环境因素对禾谷丝核菌菌核形成的影响

为了探讨影响禾谷丝核菌（R．cerealis）菌核形成的主要因素，在不同温度、培养基酸碱度、光照、碳氮营养等条件下对R．cerealis的生长状况和菌核形式进行了观察和分析。结果表明，温度、pH值、光照、碳氮营养对R．cerealis菌核的形成均有极显著影响。R．cerealis菌核形成的适宜温度为18～25℃，适宜pH值为5．0～7．0，暗培养或光暗交替培养有利于菌核形成；在碳、氮营养中，葡萄糖和NO3^--N最有利于R．cerealis菌核的形成，L-脯氨酸和L-亮氨酸可抑制菌核形成，但对菌丝生长无不良影响。

利用HPLC检测禾谷丝核菌菌丝对戊唑醇的吸收

建立了禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌丝吸收戊唑醇的反相高效液相色谱(HPLC)检测方法,样品经萃取净化后过HPLC检测,外标法定量。方法的最小检出量和最低检出浓度分别为0.2ng和0.01mg/kg,回收率及精密度高,能满足真菌抗药性机制研究中定量分析的要求。与传统的液体闪烁计数法相比,该方法成本低、简便、准确。同时,比较了用戊唑醇处理后,敏感菌株和不同抗性水平菌株对戊唑醇的吸收及药剂在菌株体内的积累情况。结果表明,在0.5mg/L剂量下,戊唑醇在抗性菌株体内的积累浓度要小于在敏感菌株体内,处理后24h,敏感菌株体内戊唑醇的浓度要比高抗菌株高127.74%,比两个中抗菌株也分别高47.72%和7.83%。

禾谷丝核菌原生质体的制备及遗传转化体系的探索

禾谷丝核菌侵染小麦引起的纹枯病是一种严重的土传病害,已成为中国小麦高产稳产的重要威胁。为进一步开展禾谷丝核菌的致病机理等研究,通过对酶种类、菌丝酶解时间及渗透压稳定剂等因素进行原生质体制备条件的优化,进一步尝试了PEG-原生质体转化和土壤农杆菌介导的转化方法进行禾谷丝核菌的转化。建立了禾谷丝核菌高效、稳定的原生质体制备体系,通过形态学、生长速率及致病性的比较发现原生质体再生菌株和原始菌株之间差异不显著。多次尝试两种转化方法,没有获得禾谷丝核菌的遗传转化子。原生质体制备体系的获得为禾谷丝核菌遗传转化、原生质体融合等体系的建立奠定了基础。

利用荧光定量PCR检测禾谷丝核菌的相对生物量

小麦纹枯病是以禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染为主的小麦土传病害。为建立检测禾谷丝核菌在寄主小麦(Triticum aestivum)中的相对生物量的可靠方法,促进小麦抗纹枯病机制的研究,本研究克隆了禾谷丝核菌肌动蛋白基因RcActin的部分(3′端)cDNA,并设计了RcActin的特异引物。该引物不仅能区分禾谷丝核菌与寄主小麦,还能区分全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等常见小麦土传病害的病原菌,表明该引物能用于小麦纹枯病的分子检测,也能用于相对表达量的测定。利用相对定量法,以RcActin相对于寄主管家基因的相对表达量作为禾谷丝核菌相对生物量的指标,结果表明,此方法能准确反映禾谷丝核菌在寄主中的相对生物量和对小麦纹枯病抗性程度进行快速鉴定。

江苏几种作物病原丝核菌生物学特性的研究

对江苏省不同作物纹枯病菌菌株生物学特性进行比较研究,结果表明,来源于水稻、玉米、大豆和棉花的菌株属于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani KOhn),经融合群测试,水稻、玉米、大豆为立枯丝核菌AG_1-1A群,棉花为AG_4群;来源于大、小麦的菌株,同属于禾谷丝核菌(R.cerealis Vander Hoeven)的CAGl群。

粉唑醇对禾谷丝核菌的抑菌活性及其对小麦纹枯病的田间防效试验

[目的]探究粉唑醇对小麦纹枯病的防控潜力。[方法]开展粉唑醇对禾谷丝核菌的抑菌活性分析及其对小麦纹枯病的田间防效试验。[结果]粉唑醇对供试菌株具有较高的抑菌活性,平均EC_(50)值为(0.438±0.073) mg/L,且1%粉唑醇颗粒剂以749.62 g a.i./hm^(2)用量处理后对小麦纹枯病的田间防效高达100.00%。[结论]粉唑醇为三唑类甾醇脱甲基化抑制剂类杀菌剂,对担子菌和子囊菌引起的病害具有较好的防控效果。

禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性及抗药性菌系生物学特性

在含戊唑醇PDA平板培养基上,对禾谷丝核菌进行逐代处理,以诱导其抗药性菌系;比较抗性和敏感菌系的生物学特性,测定抗性菌系对其它杀菌剂的交互抗性。结果表明,选育至35代,对戊唑醇抗性达33.4倍。抗戊唑醇菌系与敏感亲本菌系相比,其菌丝生长速率、菌丝干重、菌核产生速率、菌核数及干重均存在差异。抗性菌系较敏感菌系对冬小麦幼苗的致病力减弱,但小麦返青后抗性菌系引起的发病率和严重度均较敏感菌系增强。戊唑醇抗性菌系对三唑酮、丙环唑、井冈霉素、福美双、噁醚唑和咯菌腈6种药剂分别产生了31.2、22.8、16.9、15.8、15.5和1.6倍的交互抗性。

抗戊唑醇禾谷丝核菌菌株对不同碳氮营养源的利用

用菌落直径法和菌丝干重法研究了查彼克(Czapek)培养基中葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘油5种碳源和硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、尿素、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、胱氨酸、赖氨酸12种氮源对抗戊唑醇禾谷丝核菌Rhizoctoniacerealis菌株生长的影响,以探明抗性菌株和敏感菌株之间生理适合度的差异。结果表明,在不同碳源条件下,所有菌株都在蔗糖、甘油和葡萄糖中生长最快,培养7天后,菌落直径和菌丝干重分别可达3.1750～7.5667cm和0.0334～0.0554g,在木糖和果糖中生长相对较慢;在相同碳源条件下,高抗菌株(WWL)的生长速度小于敏感菌株(WW)和中抗菌株(WX1和WX2),敏感菌株和中抗菌株之间的生长速度差异不明显。在不同氮源条件下,所试菌株均能较好利用硝酸盐、亚硝酸盐、精氨酸和丙氨酸,菌落直径和菌丝干重分别可达6.2～8.8cm和0.0336～0.0543g,不能充分利用胱氨酸,菌落直径和菌丝干重分别仅为1.4217～3.4750cm和0.0178～0.0297g;在同一氮源条件下,高抗菌株的生长速度小于敏感菌株和中抗菌株,而敏感菌株和中抗菌株之间差异不明显。

禾谷丝核菌基因组SSR标记的开发及评价

群体遗传学研究对于了解病原菌的流行、变异及进化规律具有重要意义。但是到目前为止,对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构的了解并不深入,缺乏有效的SSR标记是主要原因。本研究根据禾谷丝核菌全基因组序列进行了微卫星位点搜索并设计SSR引物,通过电泳筛选和测序验证,最终筛选出12个多态性较好且稳定可靠的SSR标记。利用这些标记对收集自我国安徽、江苏、河南三省的23个禾谷丝核菌菌株进行了多态性分析,结果发现禾谷丝核菌基因组中长片段微卫星位点较少。12对引物扩增出的等位基因数平均为6.1个,期望杂合度平均为0.651,观测杂合度平均为0.508,表明这些标记具有较高的多态性,能够满足禾谷丝核菌群体遗传学研究需要。本研究为进一步进行禾谷丝核菌的多样性、群体遗传结构分析及进化学研究提供了有效工具。