兰科植物原地与迁地种子共生萌发应用

原地种子共生萌发与迁地种子共生萌发是近年来野生兰科植物繁育的新技术。介绍两种共生萌发技术国内外的应用现状,分析两种萌发技术在应用过程中出现的问题,提出两种共生萌发技术的研究趋势。

不同真菌对2种药用石斛种子共生萌发的效应

兰科石斛属植物兜唇石斛Dendrobium aphyllum和齿瓣石斛D.devonianum均为传统中药材,有着极高的药用价值。研究利用3种从不同兰科植物中分离得到的内生真菌在不同光照条件下与这2种石斛植物种子在树叶、松树皮和椰糠混合基质上进行共生萌发试验。研究结果表明,胶膜菌属Tulasnella FDaI7菌株及瘤菌根菌属Epulorhiza FDd1菌株分别能有效地促进兜唇石斛和齿瓣石斛种子的萌发及幼苗建成,石斛与真菌存在共生专一性。共生培养60 d,接菌FDaI7的兜唇石斛种子,原球茎或幼苗形成率分别为14.46%,12.07%;接菌FDd1的齿瓣石斛种子,二者形成率分别为44.36%,42.91%。在2种光照条件下,已形成的原球茎均能够进一步发育为幼苗,而持续黑暗条件会导致幼苗白化或畸形。研究结果为2种石斛的野外回归奠定了理论基础,也为这2种药用石斛人工仿生态栽培的种苗扩繁提供了新的方法。

带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定

为获得带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子萌发的共生真菌,采用原地共生萌发技术获得了2株自然萌发的小幼苗,并分离和筛选出了有效的种子萌发共生菌——瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)。为验证分离菌株对带叶兜兰种子萌发的有效性,将Phs34号菌株与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验,结果表明,经过6周的培养,对照组没有观察到种子的萌发;接菌的种子胚明显膨大,突破种皮,形成原球茎,平均萌发率为(58.35±3.41)%。这表明分离得到的瘤菌根菌能促进带叶兜兰的种子萌发。

濒危植物佛手参种子的非共生萌发及种苗的快速繁殖

离体条件下对佛手参种子进行了非共生萌发研究，成功实现了种子萌发，并通过根状茎增殖和分化获得了大量再生种苗。结果表明，成熟佛手参种子难以萌发，而未成熟种子具有萌发能力，萌发率可达到20％，最适萌发培养基为：1／2MS＋1．0-2．0mg·L-1。KT＋0．1mg·L—NAA＋10．0mg·L-1腺嘌呤；根状茎增殖最适培养基为：1／2MS＋3．0mg·L。6-BA＋0．1mg·L-1 NAA＋10．0mg·L。腺嘌呤；芽分化最适培养基为：1／2MS＋I．0mg·L-1 KT＋10．0mg·L-1腺嘌呤。较高浓度的细胞分裂素（1．0mg·L。KT）与较低浓度类生长素（O．1mg·L-1 NAA）的配比对佛手参种子萌发、根状茎增殖及芽分化具有明显的促进作用；较高浓度的NAAA制种子萌发。根状茎与愈伤组织的增殖能力无明显差异，但前者的分化能力却显著高于后者。

白旗兜兰种子非共生萌发与试管苗快速繁育

对我国极小种群野生植物白旗兜兰的种子非共生萌发与试管苗快速繁育开展研究,对比了不同培养基、预处理、种子成熟度及光照对种子萌发的影响。白旗兜兰种子萌发的最适条件是授粉后270 d的种子,在1/4MS+10%椰汁培养基上,用1%Na OCl溶液处理种子40 min并在播种后的前4周进行黑暗培养。最适合原球茎转化幼苗的培养基是3.0 g·L-1花宝一号+1.0 mg·L-1NAA+0.5 g·L-1活性炭+10%香蕉匀浆,而最佳幼苗生根壮苗的培养基是3.0 g·L-1花宝一号+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+0.5 g·L-1活性炭+10%香蕉匀浆。

硬叶兰种子的迁地共生萌发及有效共生真菌的分离和鉴定

兰科植物的种子原地和迁地共生萌发技术是近年发展起来的开展兰科植物种子和共生真菌研究的有效方法。该研究对兰属(Cymbidium)附生植物硬叶兰(C.mannii)开展了种子的迁地共生萌发研究,试图获得其种子萌发的有效真菌。利用硬叶兰成年植株根部周围的树皮、苔藓、枯枝落叶、腐殖质等作为培养基质,进行种子的共生培养。在培养133天后,成功地获得了处于不同阶段的已萌发种子、原球茎和幼苗,并从原球茎中分离得到一种瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌。用所分离到的FCb4菌株和一种从兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)分离到的胶膜菌属(Tulasnella)FDaI7菌株和硬叶兰种子在燕麦琼脂培养基上进行共生萌发,设置不接菌作为对照处理,以检验FCb4菌株对硬叶兰种子萌发的有效性。经过58天的培养,不接菌的对照处理中种子没有萌发,接种FCb4和FDaI7菌株的处理都有很高的种子萌发率,两种接菌处理在不同光照条件下的种子萌发率均无显著性差异。但暗培养条件下,种子萌发形成原球茎后,表现出生长停滞的趋势,仅有很少的原球茎继续生长达到幼苗阶段,说明原球茎发育后期与幼苗发育阶段需要光照。在光照条件下,接种FCb4菌株处理中达到幼苗阶段种子的比例为(25.67±9.27)%,显著高于接种FDaI7菌株处理的(3.04±2.27)%(W=56,p=0.026,Mann-WhitneyU-test),表明此研究中分离到的瘤菌根菌属真菌能有效地促使硬叶兰种子萌发并生长发育到幼苗阶段。

共生真菌对兰科植物种间杂交后代种子萌发的效应

石斛属(Dendrobium)植物在种子共生萌发过程中与真菌有着较为专一的共生关系,为探讨这种共生关系在种间杂交后代上的进化和适应,深入理解兰科植物和真菌共生关系的形成机制,该研究利用能有效促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)和齿瓣石斛(D.devonianum)种子萌发形成幼苗,并具有较强专一性的胶膜菌属(Tulasnella)真菌SSCDO-5和瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌FDd1,开展真菌对铁皮石斛和D. tortile种间杂交种子萌发效应的研究。结果表明,在真菌与种子共生培养68天时,SSCDO-5菌株和FDd1菌株都能有效地促进杂交种子形成原球茎和幼苗,两个接菌处理之间无显著差异,来源于铁皮石斛的SSCDO-5菌株不但没有表现出优势,反而在杂交石斛幼苗形成率上低于来源于齿瓣石斛的FDd1菌株(SSCDO-5:(22.13±6.62)%;FDd1:(29.53±5.51)%);SSCDO-5菌株和铁皮石斛在幼苗形成和发育阶段的共生专一性并没有在杂交后代上得到遗传或表现,或者说是杂交打破了这种专一性的共生关系,使得杂交后代能够和不同的真菌建立新的共生关系。该结果不支持关于共生真菌专一性是石斛属植物杂交后代形成的重要限制因素的假设,推测石斛属植物在幼苗分化和发育阶段与真菌这种专一性的共生关系是在适应特定生态环境的过程中形成和建立的。

华石斛原生境条件下人工播种的初步探讨

由于人为的采挖和原生境的破坏,华石斛野生资源受到严重威胁。因此,保护华石斛野生资源及其生境,加快野生植株的繁殖显得非常重要。该研究以华石斛种子为材料,分别于7月和9月,播种于不同的附生宿主树种(毛绵杜鹃,竹叶松,碎叶蒲桃,大叶布拉栎和大果马蹄荷),并监测其种子萌发的状况。研究结果表明:(1)华石斛种子对附生树种有一定的选择性。人工播种的毛绵杜鹃上均有原球茎萌发,萌发率达到100%,平均每株树萌发14.71个原球茎。竹叶松和碎叶蒲桃上的原球茎数增加的差异不明显,对照大叶布拉栎和大果马蹄荷则没有原球茎萌发。(2)播种时间影响华石斛种子萌发与原球茎的形成。7月份播种的毛绵杜鹃和竹叶松,原球茎萌发数较多;9月份播种的碎叶蒲桃上萌发的原球茎远远高于毛绵杜鹃和竹叶松上,达到为4.5个/株。该实验结果暗示雨季可能是华石斛播种的最佳时期。此外,人工播种树上萌发的原球茎基本集中在华石斛植株上方30cm至下方40cm的范围内,这为今后播种位置的选择提供了依据。

铁皮石斛phytocyanin基因家族全基因组分析

[目的]探讨Phytocyanins(PCs)在铁皮石斛发育过程和逆境胁迫环境下的潜在功能。[方法]利用拟南芥和水稻phytocyanin基因家族蛋白序列(At PCs和Os PCs),采用本地化软件BLASTP对铁皮石斛全基因组数据库进行搜索,并采用SMART和pfam数据库验证质体蓝素样结构域,获得铁皮石斛phytocyanin基因家族编码序列(Do PCs);利用Signal P4.1、Big-PI Plant Predictor、Net NGlyc1.0 Server等在线软件对Do PC家族序列的结构特点进行分析;利用软件Clustal W和MEGA对Do PC基因进行氨基酸序列的比对和系统进化分析;利用转录组数据绘制heatmap图对Do PCs基因在与美孢胶膜菌共生萌发的种子中的表达情况进行分析。[结果]显示:铁皮石斛全基因组中共预测到包含PCLD结构域的38个Do PCs,可分属4个亚家族,2个Cys残基在Do PCs家族中高度保守;19条Do PCs蛋白序列含有4个完整的保守铜结合配体(His、Cys、His、Gln/Met),有32条Do PCs骨架中含有N-端信号肽,22条Do PCs含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点,有27条Do PCs含N-糖基化位点;16个Do PCs基因在与美孢胶膜菌共生萌发的种子中检测到表达,其中,Do UCL2,4和Do ENODL14基因表达量最高,7个基因在共生萌发的种子中明显上调表达,只有Do ENODL6基因明显下调表达。[结论]在全基因组范围内分析铁皮石斛Do PC家族蛋白结构特点,可以为探究兰科植物与微生物共生的相互作用及进一步研究兰科菌根形成的分子机制提供数据基础。

兰花种子繁殖技术概况

兰花,中国传统名花,具有较高的观赏价值.其栽培方法一般为分株繁殖,3-4年才能进行一次,生长较慢,难以满足市场需要;而且兰花培育新品种的杂交育种工作也必须通过播种育苗才能达到目的.因此,兰花种子繁殖问题自然被人们所重视.由于兰花种子数量很大,开展种子快速繁殖幼苗是一条切实可行的途径.

铁皮石斛GRAS转录因子家族基因SCL3克隆及表达分析

GRAS家族是一类植物特有的转录调控因子,参与调控植物生长发育及抵御逆境胁迫,并且在赤霉素(gibberellins, GAs)信号转导过程中具有重要作用。本研究采用RT-PCR结合RACE方法从铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)原球茎中克隆到了一个转录因子GRAS家族基因SCL3 (scarecrow-like 3)并对其进行了表达分析。该基因cDNA序列全长2 278 bp,命名为DoSCL3 (GenBank注册号:MG252261),其编码425个氨基酸,分子量为47.88 kD,等电点(PI)为6.21。DoSCL3基因编码的蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GRAS转录因子家族特有的保守结构域(22~422);多序列比对表明,DoSCL3与小兰屿蝴蝶兰的SCL3蛋白高度同源(相似性达到83%),同时进化树分析结果显示其与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系非常相近。qRT-PCR实验结果显示,DoSCL3基因在铁皮石斛种子共生萌发中随着萌发进程的变化(1~3级,萌发至原球茎阶段)其表达量逐渐升高,并且在种子萌发至2级时,共生萌发组表达量显著高于无菌萌发组(为无菌组2.2倍),表明DoSCL3在兰科药用植物铁皮石斛种子共生萌发中菌根共生关系的建立过程起到重要的调控作用。