疟原虫种属同检多重PCR方法的建立和应用

目的建立高效的疟原虫种属特异性检测方法。方法设计疟原虫种(核糖体18S rRNA,4对)和属(线粒体基因,1对)特异性引物,与通用引物(5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′)连接后,形成5对嵌合特异性引物。常规PCR确定各对引物的最佳退火温度和引物浓度,多重PCR优化5对引物混合后的最佳反应条件,建立反应体系(命名为P5-mPCR方法)。用P5-mPCR检测不同原虫密度的间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫(Po)、恶性疟原虫(Pf)感染者血样和模拟混合感染样品,确定P5-mPCR方法的检测灵敏度。用日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫感染者血样或虫体DNA评价P5-mPCR方法的特异性。用212份疟疾送检血样,与巢式PCR方法比较评价其应用价值。结果优化后的P5-mPCR反应体系各组分含量(体积比)为:DNA模板10%、引物Mix 5%、dd H_2O 35%,Taq酶预混液50%。反应体系的最佳循环条件为:95℃ 5 min;94℃ 15 s,58℃ 20 s,72℃ 20 s,循环5次;94℃ 15 s,62℃ 20 s,72℃ 20 s,循环10次;94℃ 15 s,68℃ 20 s,72℃ 20 s,循环25次;72℃ 3 min;10℃ 5 min。扩增产物的长度分别为:Pv 778 bp,Pm 582 bp,Po 400 bp,Pf 256 bp,疟原虫属334 bp。其检测灵敏度分别为4.49、5.45、6.39、4.07个虫/μl血(种特异性检测平均值为4.85个虫/μl血)和0.10~1.07个虫/μl血(属特异性检测的平均值为0.41个虫/μl血)。P5-mPCR检测含有50~200个虫/μl血的模拟混合样品,各特异性扩增条带均清晰可见;检测日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫样品,结果均为阴性。巢式PCR和P5-mPCR检测212份疟疾送检血样,两种方法检测结果的一致性较高(Kappa=0.866,P<0.01),检出的阳性率分别为75.0%(159/212)和79.7%(169/212),差异具有统计学意义(χ~2=8.100,P<0.01)。从分型诊断来看,两者的差异主要来源于Pf(P<0.01)和Po(P<0.05)样品,对Pv、Pm和混合感染血样的检测结果,两种方法差异无统计学意义。结论建立的P5-mPCR方法具有敏感性高,特异性好,操作简便快速,检测结果易于判断,一次反应即可确定4种人体疟原虫。