基于种特异性COI引物(SS-COI)的桉树枝瘿姬小蜂A、B隐种快速鉴定技术

隐种A和隐种B是桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa两种重要的全球入侵隐种,对多国林业生产造成了严重危害。由于桉树枝瘿姬小蜂体型微小,且无法从形态上区分隐种类型,给该害虫的防治造成困难。本研究基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mtDNA COI)基因序列的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR方法,研究桉树枝瘿姬小蜂隐种快速分子检测技术。基于隐种A、B的COI序列分别设计特异性SS-COI引物各1对(AF/AR和BF/BR)。使用这两对引物扩增同一桉树枝瘿姬小蜂样品DNA,即可有效进行隐种鉴定,同时两对引物也能互相验证鉴定结果。引物鉴定灵敏性检测结果显示,AF/AR与BF/BR均具有较高的鉴定灵敏性,其对DNA的有效鉴定浓度阈值分别为11.42 pg/μL和28.32 pg/μL。本研究开发的桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的快速鉴定方法解决了桉树枝瘿姬小蜂入侵地区隐种鉴别的难题,极大缩短鉴定时间、降低鉴定费用,为进一步探究桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的生物学差异以及它们对不同抗性品种桉树的适应能力提供技术参考。

杨属派间5个种特异性InDel引物及在派间杂交子代鉴别中的应用

【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小叶杨中种特异性InDel位点设计引物,并利用SeqHunter2依次比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,再用杨属5个派的自然群体材料进行种内保守及种间多态引物的试验验证,筛选出杨属不同派的特异性引物序列,对杨属不同派间杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将从美洲黑杨基因组设计的5000对InDel引物依次分别比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,最后筛选出341对引物在上述5个种中是通用的。从不同染色体上共选取48对引物并合成,利用5个树种各1个DNA检测得到43对引物是通用的,其中19对引物在不同种中扩增条带单一且存在差异。利用自然群体混合DNA对试验验证的19对通用引物进行种间多态性和种内保守性检测,初步获得4对多态性引物。最后再用自然群体DNA对这4对引物进行扩增检测,发现引物Chr12_4341229和Chr13_10582756在美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨中均只能扩增出一个位点,引物Chr12_4341229扩增条带分别为148、152、113、152和159 bp,引物Chr13_10582756扩增条带分别为140、144、116、140和159 bp。利用上述2对引物对小胡杨2号、黑胡杨和黑小杨进行鉴定,发现所有杂交子代个体均能检测它们2个亲本的特征带。引物Chr12_4341229和Chr13_10582756一起使用,可以用于美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨任意组合杂交子代的真实性鉴别。【结论】本研究获得了杨属5个派间的5个种的特异性InDel引物2对,可以有效地进行杨属不同派5个种之间任意组合种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步开展杨树派间杂交创制新种质提供了技术支持。

簸箕柳×三蕊柳种特异性KASP标记开发及种间杂交子代鉴别

【目的】开发簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,为开展簸箕柳和三蕊柳杂交选育速生、抗虫新种质的真实性鉴定提供参考。【方法】利用簸箕柳和三蕊柳重测序数据,开展全基因组SNP位点分析,筛选出种特异性的SNP位点并设计KASP引物,利用SeqHunter2检测设计引物在簸箕柳中的通用性,并利用簸箕柳和三蕊柳自然群体材料对合成的引物进行实验验证,筛选出簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,并对它们的杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将三蕊柳和簸箕柳重测序的数据比对到三蕊柳基因组,共获得个6598144个SNPs。经过筛选,最终在簸箕柳中检测到674144个和三蕊柳相比为纯合突变的位点。从每条染色体上随机选取100个位点用于KASP引物设计,在1900个SNPs位点中,750个SNP位点可以成功设计出KASP引物。从每条染色体上选取2组,共选取38组引物,通过SeqHunter2检测得到11组引物在簸箕柳中是通用的。利用簸箕柳和三蕊柳自然群体DNA对合成的10组通用引物进行种内保守和种间差异性检测,获得4组在簸箕柳、三蕊柳和种间杂交子代中聚类明显的引物。引物Stri08_82809、Stri14_11602、Stri14_12274和Stri17_10731在簸箕柳自然群体中分别扩增出纯合G/G、T/T、A/A和T/T位点,在三蕊柳自然群体分别扩增出纯合A/A、C/C、G/G和C/C位点,而在真实杂交子代中分别扩增出G/A、T/C、A/G和T/C杂合位点。利用上述4组引物对簸箕柳×三蕊柳的杂交子代进行鉴定,发现在31个杂交子代中,29个个体扩增出杂合位点,说明同时遗传了2个亲本的特征位点,为真实的种间杂交子代。有2个个体扩增的位点为纯合且和母本相同,说明这2个子代为簸箕柳花粉污染的子代。【结论】本研究获得了簸箕柳和三蕊柳种间特异性KASP标记4组,可以准确快速的开展簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步簸箕柳和三蕊柳种间杂交及回交创制抗虫新品种提供了技术支持。

利用种特异性COI引物(SS-COI)鉴别扶桑绵粉蚧

扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley是我国近年新发现的一种严重威胁农林业生产的重要外来入侵害虫。针对扶桑绵粉蚧与其他粉蚧类昆虫难以准确快速识别且适生区广泛的问题,以扶桑绵粉蚧为靶标,以我国常见的其他7种粉蚧为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COI)基因序列的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR方法,研究其快速分子检测技术。通过已知粉蚧的COI基因序列设计通用型引物1对,获得扶桑绵粉蚧及其他7种粉蚧包括康氏粉蚧Pseudococcus comstocki Kuwana、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacius Cockerell、木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus(Green)、甘蔗红粉蚧Saccharicoccus sacchari(Cockerell)、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley、番石榴粉蚧Planococcus minor Maskel和石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani Ferris的COI基因序列,根据测序结果及数据库中已知粉蚧的COI基因序列设计SS-COI引物1对(PSZTF1/PSZTR1),其扩增片段大小为546bp。种特异性检验结果表明,该引物只对扶桑绵粉蚧的COI基因具有扩增能力,对其他7种粉蚧不具有扩增效果;该引物不仅对成虫具有良好的扩增能力,对不同虫态的扶桑绵粉蚧以及来自我国不同省市的14个地理种群和口岸截获的来自巴基斯坦的扶桑绵粉蚧亦具有同样的扩增效能。这些结果表明,该技术体系完全可用于扶桑绵粉蚧的准确识别及其检测监测,对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。

桑粉虱种特异性引物筛选

【目的】桑粉虱Pealius mori(Takahashi)与其他种类粉虱形态相似,识别困难。设计、筛选桑粉虱种特异性引物,为桑粉虱检测和鉴定提供理论依据。【方法】DNAMAN软件比较与桑粉虱同源性较高的国内外具有代表性的7种粉虱线粒体COⅠ基因序列,应用Primer 5.0软件设计5对桑粉虱COⅠ基因特异性引物。将各对引物与不同种类粉虱成虫基因组DNA模板进行PCR扩增,检测目的条带,筛选桑粉虱种的特异性引物。以桑粉虱的卵和幼虫基因组DNA为模板,验证所筛选出的桑粉虱种特异性引物的灵敏性。【结果】2对桑粉虱种特异性引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2对桑粉虱单头成虫基因组DNA的PCR扩增产物分别为450、300 bp,而对烟粉虱B型、温室白粉虱无扩增效果。2对引物对桑粉虱DNA模板浓度最低检测值分别为0.15 pg/μl、0.15 ng/μl。引物sfs1-1/sfs1-2灵敏性较引物sfs5-1/sfs5-2高1000倍。2对引物对桑粉虱成虫、幼虫及卵粒的线粒体COⅠ基因皆具较好扩增能力。【结论】引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5具桑粉虱种的特异性,引物sfs1-1/sfs1-2为桑粉虱检测、鉴定的首选引物。

基于种特异引物(SS-COI)快速鉴定锈红果实蝇

[目的]开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究。[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列,筛选设计了一对能够准确鉴定锈红果实蝇的种特异性引物XF29和XR293,选用锈红果实蝇作为阳性对照,颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)等19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增和电泳检测。[结果]仅阳性种锈红果实蝇在约265 bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余实蝇均未出现任何条带。[结论]采用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ基因序列筛选设计的特异引物种特异性和稳定性强,可为进出境果蔬检疫、疫情早期预警和有效监测防治提供快速鉴定的依据。

基于种特异性COI标记的新入侵种甘蓝粉虱快速鉴定技术

【目的】针对粉虱类害虫种类多、体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以新入侵我国大陆的甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(L.)为靶标,以田间常见的其他10种/隐种粉虱为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mt DNA COI)基因的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR方法,研究其快速分子检测技术。【方法】利用mt DNA COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得甘蓝粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计种特异性SS-COI引物1对(APZYJF/APZYJR),其扩增片段大小为384 bp,同时对该对引物的种特异性及灵敏性进行检测。【结果】种特异性检验结果显示,该对引物仅对甘蓝粉虱的mt DNA COI基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括温室粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)、柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)、螺旋粉虱Aleurodicus disperses(Russell)、双钩巢粉虱Paraleyrodes pseudonaranjae Martin、非洲伯粉虱Bemisia afer(Priesner et Hosny)以及烟粉虱B.tabaci(Gennadius)5个隐种(MED,Asia I,Asia II 1,Asia II 3和China 1)等不具有交叉反应扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增效能,对2-4龄若虫甚至单粒卵或单头初孵若虫亦具有同样的扩增能力,其最低检测阈值为14.00±0.37 pg/μL(相当于1/25 600头雌性成虫)。【结论】该技术体系完全可用于甘蓝粉虱的快速准确识别及检测监测,对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。

应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇

[目的]为了促进果蔬进出口贸易和快速通关,防止瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]进一步传入扩散,迫切需要开展适合实蝇快速鉴定技术的研究。[方法]应用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ序列,设计了1对能够准确鉴定瓜实蝇的种特异性引物GF85和GR531。选用瓜实蝇作为阳性对照,南瓜实蝇[B.tau(Walker)]、具条实蝇[B.scutellata(Hendel)]等其他19种待测实蝇作为阴性对照,提取供试虫样基因组DNA,并进行PCR扩增和电泳检测。[结果]仅虫样瓜实蝇能在约447 bp位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余的虫样未出现条带。[结论]将该试验建立的SS-PCR鉴定方法应用于实际进出境果蔬截获和疫情监测的虫样的鉴定,并得到验证,表明该方法具特异性、稳定性强,可在实际的实蝇鉴定工作中应用。

基于mt DNA COⅠ设计种特异性引物快速鉴定具条实蝇

具条实蝇(Bactrocera scutellata Hendel)为我国进境植物检疫性有害生物,为探索其快速鉴定技术,基于mt DNA COⅠ设计一对能够准确鉴定具条实蝇的种特异性引物JF190和JR386,以具条实蝇作为阳性对照,颜带实蝇(B.cilifer Hendel)、黑颜实蝇(B.diaphora Coquillett)和黑膝实蝇(B.scutellaris Bezzi)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增后将其产物进行电泳检测。结果表明,仅目标种具条实蝇能够在约197 bp扩增出一条单一且清晰的的条带。说明本研究建立的方法特异性强,鉴定快速,且在实际检疫鉴定工作中已得到验证,适用于实蝇的快速鉴定和疫情监测。

重大检疫性害虫玉米根萤叶甲的种特异性SS-CO Ⅰ快速检测技术研究

玉米根萤叶甲在欧洲和美国是一种严重为害玉米的入侵性害虫,传播速度快,侵入我国的可能性极高。本文针对其难以快速准确进行形态鉴别的问题,以玉米根萤叶甲为研究对象,以其他9种/生物型叶甲总科常见害虫为参照,采用基于COⅠ基因的种特异性PCR方法(species-specific COⅠ, SS-COⅠ),研究其快速分子检测鉴定技术。通过提取10种/生物型叶甲DNA和通用型引物扩增测序,获得其基因片段的碱基序列,并比对分析设计1对玉米根萤叶甲特异性引物(DvvZCE1/DvvZCF1),其扩增片段为462 bp。种特异性检验结果显示,该对引物只对玉米根萤叶甲的COⅠ基因具有扩增能力,对其他常见叶甲类害虫,包括玉米双斑长跗萤叶甲、榆黄毛萤叶甲、黄曲条跳甲、油菜蚤跳甲、黄点直缘跳甲、莲草直胸跳甲、枸杞负泥虫以及褐足角胸叶甲的棕黄型和蓝绿型没有扩增能力,该对引物不仅对成虫有很好的扩增效果,对单粒卵、2龄幼虫以及成虫残体(包括触角、头部、胸部、腹部、前足、后足)也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为102.73 pg/μL(相当于1/122 880头雌性成虫)。玉米根萤叶甲特异性SS-COⅠ检测技术在其口岸检疫,以及有效阻截中具有重要意义。

双钩巢粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

【背景】双钩巢粉虱是近年在我国南方新发现的一种入侵害虫，其寄主范围广，危害严重，进一步扩散蔓延趋势明显。【方法】针对粉虱类害虫体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题，以双钩巢粉虱为靶标，以我国常见的其他8种／隐种粉虱为参照，采用基于mtDNACOI基因的种特异性SS—COI方法，研究其快速分子检测技术。利用COI通用型引物LCO．1490／HCO．2198获得双钩巢粉虱及其他常见粉虱的COI序列，根据测序结果设计特异性SS—COI引物1对（PPZYFl／PPZYRl），其扩增片段大小为233bp。【结果】种特异性检验结果显示，该引物只对双钩巢粉虱的COI基因具有扩增能力，对其他种／隐种粉虱，包括烟粉虱的不同隐种（MEAMl隐种、MED隐种、AsiaⅡ3隐种和AsiaII1隐种）以及温室粉虱、柑橘粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱等不具有扩增效果。该引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增能力，对1—4龄若虫和单粒卵亦具有同样的扩增效能，其最低检测阈值为1／40960头雌性成虫。【结论与意义】本检测技术对口岸检疫以及观赏植物、果树及其种苗调运中的害虫检测、监测意义重大。

火红熊蜂微卫星标记的筛选及种特异性分析

火红熊蜂Bombus pyrosoma是中国特有的熊蜂资源,在华北地区分布十分丰富,是众多野生植物和农作物的重要传粉者。为了探究火红熊蜂的遗传结构及其进化关系,首次开展了该种熊蜂卫星标记的筛选及其种特异性研究。本研究采用生物素-磁珠吸附分离法从火红熊蜂基因组中筛选微卫星标记,并选取黑熊蜂亚属Melanobombus其他7种熊蜂进行了这些标记的种特异性验证。结果表明:不同探针与磁珠杂交产生的微卫星标记阳性克隆率存在很大差异,TC探针的微卫星阳性克隆率最高为82%;TG探针次之,为28%;AT和GC探针分离未获得微卫星标记克隆。根据获得的阳性克隆的序列设计引物进行筛选验证,共获得31对熊蜂微卫星序列特异性引物。微卫星标记分析发现,完美型(perfect)18个,占58.1%;非完美型(imperfect)10个,占32.3%;混合完美型(compoundperfect)1个,占3.2%;混合非完美型(compound imperfect)2个,占6.4%。不同探针的微卫星核心序列重复数不同,TC探针和TG探针的微卫星核心序列最高重复数分别为28和15个,最低重复数分别为7和11个。利用所获得的31对微卫星引物对黑熊蜂亚属其他7种熊蜂进行检测,有26对引物可以扩增所测试的7种熊蜂,其他5对引物只能扩增部分熊蜂种类,其中BPM5是火红熊蜂种特异性引物。本研究从火红熊蜂基因组中筛选的微卫星标记,不仅可用于火红熊蜂的遗传结构、分子进化和资源保护等方面的研究,而且可进一步用于黑熊蜂亚属其他种群的遗传特性分析。

基于物种特异性InDel标记鉴别美洲黑杨与小叶杨的杂交子代

【目的】针对杨树种间杂交子代苗期形态不易区分的问题,利用美洲黑杨和小叶杨物种特异性InDel位点开发标记对种间杂交子代进行快速鉴别,为黑杨派和青杨派种间杂交子代鉴定、分子标记辅助育种等研究提供重要的参考技术。【方法】以美洲黑杨、小叶杨及其杂交子代为试验材料,根据美洲黑杨和小叶杨重测序结果分析物种特异性InDel位点并设计引物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物进行通用性和物种特异性检测,用筛选出的物种特异的引物,对种间杂交子代的真实性进行鉴别。【结果】分别将10个个体的美洲黑杨和小叶杨重测序序列比对到美洲黑杨基因组,共获得长度差异大于5 bp的InDel位点359733个,其中种内特异、种间存在差异的InDel位点18418个。采用Primer3在美洲黑杨基因组中的17956个位点成功设计引物。在不同染色体共选取10对引物,采用SeqHunter2将引物序列比对到小叶杨基因组,共有6对引物在小叶杨中是通用的。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现引物Psi2-1和Psi13-14在美洲黑杨和小叶杨中存在差异。利用美洲黑杨和小叶杨自然群体各50个个体对上述2个引物进行检测,发现引物Psi2-1在美洲黑杨中扩增出128 bp的特异性产物,在小叶杨中扩增出139 bp的特异性产物,在真实的种间杂交子代中扩增出128 bp和139 bp 2条产物;引物Psi13-14在美洲黑杨中扩增出132 bp的特异性产物,在小叶杨中扩增出144 bp的特异性产物,在真实的种间杂交子代中扩增出132 bp和144 bp 2条产物。2对引物对美洲黑杨与小叶杨种间杂交子代鉴别准确率达100%。【结论】获得了美洲黑杨和小叶杨物种特异性InDel标记2对,上述标记可以有效地用于美洲黑杨与小叶杨种间杂交子代的真实性鉴别。

利用物种特异性PCR技术快速鉴定南瓜实蝇

【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的种特异性引物NF404和NR610,并进行PCR检测和验证,建立一种利用种特异性引物的快速鉴定方法。【结果】南瓜实蝇在207 bp的位置扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余果实蝇未见条带。将截获的南瓜实蝇与其同亚属的近缘种具条实蝇、瓜实蝇的不同虫态和成虫部分虫体组织的虫样,采用本实验室建立的SS-PCR鉴定方法进行验证,结果一致。【结论】建立的南瓜实蝇的SS-PCR鉴定方法种特异性和稳定性强,能快速鉴定目标种类,解决口岸进境果蔬中截获实蝇幼虫、蛹等不同虫态和残体难于快速鉴定问题。

基于种特异性COI标记的花生蚜快速鉴定技术

针对花生蚜虫体型小、在田间不易准确快速识别的问题。本文采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome coxidase subunit I,mtDNA COI)基因的种特异(species-specific COI)PCR方法,研究了其快速鉴定的分子技术。研究利用mtDNA COI基因通用型引物F-LCO-1490/R-HCO-700ME获得青岛地区花生蚜虫COI基因序列,并根据测序结果设计六对花生蚜特异引物,同时以同一花生田采集的、与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物的166个DNA样本为模板对六对引物的种特异性进行了检测。PCR结果显示,引物AC_F2/AC_R2对花生蚜基因组模板有特异扩增能力,片段长度为299bp;且该对引物在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中均未扩增出条带,显示出此种特异性引物对其他物种不具有交叉反应扩增能力,可用于花生蚜的快速检测及预测预报,同时对本地天敌对花生蚜捕食作用的检测也具有重要意义。

入侵害虫梣粉虱的种特异性SS-CoⅠ检测技术

【目的】梣粉虱是新近入侵中国大陆的一种危险性果树和园林植物害虫,针对其体型微小,与近缘种粉虱形态相仿,很难快速准确区分的问题,以田间常见的11种/隐种粉虱为参考,采用基于mt DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunitⅠ,mt DNA COⅠ)基因的物种特异性(species-specific COⅠ,SS-COⅠ)PCR法,研究梣粉虱快速分子检测鉴定技术。【方法】利用mt DNA COⅠ基因通用型引物对LCO-1490/HCO-2198获得梣粉虱和其他常见粉虱的COⅠ基因序列,根据测序结果设计梣粉虱特异性SS-COⅠ引物1对(SPZWCF1/SPZWCR1),之后确定其对目的片段的扩增长度,并对该引物对的物种特异性和检测灵敏性进行检验。【结果】引物对SPZWCF1/SPZWCR1扩增片段的长度为426 bp。物种特异性检验结果显示,该对引物只对梣粉虱的mt DNA COⅠ基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括5种烟粉虱隐种(AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED、MEAM1隐种)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱等不具有交叉反应和扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别、不同采集地的成虫具有良好的扩增效能,对2~4龄若虫以及单粒卵和初孵若虫亦具有同样的扩增效力,其最低检测阈值为75.1 pg·μL-1(相当于1/10240头雌性成虫)。【结论】该技术体系可用于梣粉虱的快速准确鉴定及其检测和监测,对有效阻截其进一步传播扩散具有重要作用。

基于种特异性PCR技术快速鉴定葡萄根瘤蚜

葡萄根瘤蚜是一种严重威胁葡萄生产的入侵性害虫。由于蚜虫类害虫种类多、体型微小、形态相似,难以快速准确地进行鉴别。文章以葡萄根瘤蚜为研究对象,以常见果树蚜虫为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的种特异性PCR方法,研究葡萄根瘤蚜的快速鉴定技术。利用mt DNA COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得葡萄根瘤蚜及其他果树常见蚜虫的COI序列,根据测序结果设计1对种特异性SS-COI引物(Vit F269/VitR557),扩增片段大小为308 bp。种特异性检验结果显示,该对引物仅对葡萄根瘤蚜的mt DNA COI基因具有扩增效果,其他5种蚜虫均没有扩增条带。

基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术

【背景】西花蓟马(Frankliniella occidentalis)是世界性农业和园艺作物害虫,也是我国重要的对外对内检疫对象。西花蓟马具有两个品系,即温室品系(greenhouse race,GR)和羽扇豆品系(lupin race,LR),二者在寄主范围、抗药性、生存环境等方面均具有明显差异,但外部形态相似,无法准确鉴别。【目的】以西花蓟马温室品系和羽扇豆品系为靶标,以田间常见的其他14种蓟马为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mtDNA COI)基因的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR法,研究一步双重品系快速检测技术。【方法】采用mtDNA COI基因通用引物获得西花蓟马温室品系和羽扇豆品系以及其他常见蓟马的COI序列,根据测序结果以及数据库已公开数据,设计筛选获得可同时扩增两个品系的特异性组合引物(TF6/GR32/LR12),其中TF6为品系通用上游引物,GR32为温室品系特异性下游引物,LR12为羽扇豆品系特异性下游引物,其扩增片段大小分别为温室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp;对组合引物比例和退火温度进行优化;同时,对组合引物的种/品系特异性和灵敏性/检测阈值进行检验。【结果】当组合引物TF6/GR32/LR12比例为1.0/0.2/0.8、退火温度为44℃时,扩增效果最好。种/品系特异性检测结果证实,该检测技术仅对西花蓟马温室品系和羽扇豆品系具有扩增能力,对田间常见的其他14种蓟马包括花蓟马(Frankliniella intonsa)、禾花蓟马(Frankliniella tenuicornis)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、大蓟马(Thrips major)、棕榈蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、豆喙蓟马(Mycterothrips glycines)、草木樨近绢蓟马(Sussericothrips melilotus)、蔗腹齿蓟马(Fulmekiola serrata)、稻简管蓟马(Haplothrips aculeatus)、榕端宽管蓟马(Mesothrips jordani)、榕母管蓟马(Gynaikothrips ficorum)和横纹蓟马(Aeolothrips fasciatus)等不具有扩增能力。灵敏性检测结果显示,该组合引物不仅对单一品系或混合品系的成虫具有良好的扩增效果,对单粒卵、1龄和2龄幼虫以及预蛹和蛹均具有同样的扩增效能;对温室品系的最低检测阈值为35.90 pg·μL^-1,相当于1/10 240头雌成虫,对羽扇豆品系的最低检测阈值为146.95 pg·μL^-1,相当于1/2 560头雌成虫;同时,对来自不同地域的同一品系不同单倍型的成虫亦具有良好的扩增效能。【结论】建立的技术体系完全可以用于西花蓟马品系的快速鉴定及检疫监管,对有效阻截其进一步传播扩散及靶向防控措施制定意义重大。

应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇

【目的】辣椒实蝇Bactrocera latifrons(Hendel)为我国重要的检疫性有害生物,其寄主范围广泛,危害严重。由于传统鉴定方法受到饲养周期、饲养条件、虫态等因素的限制,使得果蔬进出口贸易通关速度、疫情快速鉴定受到较大的影响,因此迫切需要开发关于实蝇的快速鉴定识别的技术。【方法】本研究基于mt DNA COI序列设计了一对能够准确鉴定辣椒实蝇的种特异性引物FL680和RL1057,选用辣椒实蝇作为阳性对照,选用番石榴实蝇B.correcta(Bezzi)、桔小实蝇B.dorsalis(Hendel)和颜带实蝇B.cilifer(Hendel)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】仅目标种辣椒实蝇能够扩增出清晰且单一的约378 bp的条带,其余实蝇种类均未出现条带。将本实验建立的种特异性PCR(SS-PCR)鉴定方法应用于实际检疫工作中并得到了验证,表明该方法具有强的种特异性。【结论】本文提出辣椒实蝇快速鉴定识别技术可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。

基于种特异性SS-COⅠ技术快速鉴定瘤胫实蝇

【目的】瘤胫实蝇为我国进境植物检疫性有害生物。寄主范围广、危害大,形态与其同属近缘种相似,传统鉴定方法是将果蔬上的各虫态饲养至成虫后进行分类鉴定,鉴定周期较长,影响口岸进境果蔬快速通关,而采用分子鉴定不仅快速且不受虫态影响。【方法】选用瘤胫实蝇为鉴定靶标,番石榴实蝇、锈红果实蝇等19种实蝇作阴性对照,应用种特异性技术,基于mtDNA COⅠ线粒体基因序列,研究筛选并设计一对种特异性引物(SS-COⅠ)LJF400和LJR564,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】种特异性引物仅对靶标种瘤胫实蝇的COⅠ基因有扩增能力,能扩增出一条单一的长度约165 bp清晰的条带,而对其余阴性对照种均不具有扩增效果,未出现任何条带。【结论】设计的种特异性引物具高特异性,能够快速准确鉴定瘤胫实蝇,适用于各种虫态,对瘤胫实蝇的检疫鉴定和进境果蔬的快速通关具有重要意义。