不同种群白纹伊蚊单倍型多态性、遗传分化及种系发育关系分析

【目的】试验旨在探究湖南怀化地区不同种群白纹伊蚊单倍型多态性、遗传分化情况及种系发育关系。【方法】于湖南怀化地区采集30只白纹伊蚊样本,PCR扩增其核糖体18S rRNA及线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)基因部分序列。利用ClustalX软件对其变异位点进行分析;运用Dnasp 5.0、Network 4.6及Arlequin version 3.0软件进行单倍型多态性与遗传分化分析;利用PhyML 3.0及Mega 5.0软件对白纹伊蚊的种系发育关系进行分析。【结果】所获全部样本的18S rRNA和cox 1基因序列长度均为489和1004 bp。白纹伊蚊18S rRNA基因序列中共存在30个变异位点,17个单倍型(A1~A17,Hd=0.9149),其中单倍型A5为最古老的单倍型,白纹伊蚊18S rRNA的基因分化系数(Gst)、遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)分别为0.05614、0.24001和0.792;白纹伊蚊的cox 1基因序列中共存在2个变异位点,3个单倍型(B1~B3,Hd=0.1908),其中单倍型B1为最古老的单倍型,白纹伊蚊cox 1基因的Gst、Fst和Nm分别为0.05000、0.04762和4.999。系统发育树中,来源于怀化地区的30只白纹伊蚊均分别处于2个发育树的一个分支。【结论】来源于湖南怀化地区的白纹伊蚊个体和种群之间存在一定程度基因变异和单倍型多态性现象,但各单倍型及其个体之间具有较近的亲缘关系,且两种群白纹伊蚊个体间发生了较为频繁的基因交流,未出现遗传分化。

不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系分析

为了探究不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系,本试验以采自于湖南、河南两省的褐黄血蜱(各10只,共20只)为研究对象,通过PCR扩增其细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cox1)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ(nad4)基因序列,对其单倍型多态性(Hd)、遗传分化和种系发育关系进行分析。结果显示,cox 1基因序列(849 bp)包含4个变异位点,5个单倍型(h=5,A1~A5,Hd=0.653),其基因分化系数(Gst)=0.061,遗传分化系数(Fst)=-0.047,基因流(Nm)=-5.625;nad 4基因序列(626 bp)包含3个变异位点,3个单倍型(h=3,B1~B3,Hd=0.363),其Gst=0.004,Fst=0.074,Nm=3.125;cox 1+nad 4基因序列包含7个变异位点,7个单倍型(h=7,C1~C7,Hd=0.768),其Gst=-0.010,Fst=-0.015,Nm=-16.560;在所构建的种系发育树中,20只褐黄血蜱均处于种系发育树的一个分支。结果表明,湖南、河南两省的褐黄血蜱个体之间虽表现出单倍型多态性,但它们之间具有较近的亲缘关系,尚未出现遗传分化。

陕西榆林地区鸡蛔虫的单倍型多态性、遗传分化及种系发育关系分析

为探究陕西榆林地区鸡蛔虫单倍型多态性及遗传分化情况,并阐明其种系发育关系,试验以分离于榆林不同地区的30条鸡蛔虫为样品,采用PCR扩增其线粒体cox1与nad4基因,进行单倍型多态性、遗传分化与种系发育关系分析。结果显示:在所有的cox1基因(953 bp)序列中,共含30个变异位点(4个转换、26个颠换),17个单倍型(h=17,Hd=0.936),其基因分化系数(Gst)为-0.01285,遗传分化系数(Fst)为-0.02995,基因流(Nm)为11.53;在所有的nad4基因(876bp)序列中,共含29个变异位点(2个转换、27个颠换),16个单倍型(h=16,Hd=0.9356),其Gst为-0.01238,Fst为-0.0409,Nm为17.05;在所有的cox1+nad4基因(1829 bp)序列中,共含59个变异位点(6个转换、53个颠换),24个单倍型(h=24,Hd=0.977),其Gst为-0.0039,Fst为-0.0365,Nm为14.77;在所有cox1、nad4及cox1+nad4基因的Network图中,均未发现有单倍型聚集成簇的现象,构建的种系发育树中30条鸡蛔虫均聚集于一起,共同形成种系发育树的一个分支。研究表明,分离于陕西榆林地区的30条鸡蛔虫之间虽存在一定程度的基因变异,但其个体及单倍型之间具有较近的亲缘关系,尚未出现遗传分化。

基于18S rRNA和HSP70基因序列的隐孢子虫种系发育分析

为阐明河南区域隐孢子虫分子流行病学特点,用PCR技术扩增分离虫株的18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列,并对扩增片段进行测序。用PAUP 4.0和TREEPUZZLE 4.1构建进化树,试图从分子水平证明河南省不同地区不同宿主来源隐孢子虫的遗传特征,以阐明隐孢子虫病的分子流行病学特点。通过18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列分析,其结果:河南人源隐孢子虫分离株为Cryptosporidium parvum鼠基因型;河南鹿源隐孢子虫分离株为C. parvum鹿基因型;河南猪源隐孢子虫的2个分离株均为C. parvum猪基因I型,即C. suis;河南鹌鹑源的隐孢子虫2个分离株分别为C. baileyi和C. meleagridis;河南乌鸡源隐孢子虫和鸵鸟源隐孢子虫分离株均为C. baileyi;河南牛源隐孢子虫分离株为C.andersoni。

湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列重构猬迭宫绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得各样品株的pcox1和pnad1序列长度一致,分别为396和566bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。由于猬迭宫绦虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为猬迭宫绦虫的种群体遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。

湖南省鸡蛔虫线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明湖南省鸡蛔虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建鸡蛔虫与其它科蛔虫的种群遗传关系。作者应用聚合酶链反应(PCR)扩增鸡蛔虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序MP法和Mega4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。所获得的pcox1和pnad1序列长度均为394和408bp,种系发育树表明,20个分离株鸡蛔虫位于同一分枝。由于鸡蛔虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。本研究系首次报道鸡蛔虫的pcox1和pnad1序列,从而为鸡蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础。

基于cox Ⅰ基因对猪囊尾蚴河南分离株种系发育关系的研究

利用RT-PCR技术从河南部分地域的猪囊尾蚴中获得10个分离株的cox Ι部分基因序列,其长度为344bp;将其克隆入pMD19-T并测序;分别用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用PAUP 4.0程序MP法和NJ法绘制种系发育树,并用PUZZLE 5.2程序构建最大似然树;同时利用WDANSIST 2.5程序和DNAstar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果表明,10个河南猪囊尾蚴分离株的coxΙ部分基因序列完全一致,属于猪带绦虫亚洲基因型;猪囊尾蚴coxΙ部分基因可有效区分出Asian和American/African两种基因型,并可用于不同种带科绦虫的鉴别诊断。因此,猪囊尾蚴coxΙ基因有望作为一种鉴别基因用于带科绦虫病和囊尾蚴病的PCR鉴别诊断。

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析。结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%。中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近。表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫。

基于细胞色素b氧化酶基因序列的中国大陆日本血吸虫虫株种系发育分析

为分析中国大陆日本血吸虫不同地理虫株线粒体细胞色素b(cytochrome b,cytb)氧化酶基因的遗传多态性并重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系,以cytb基因作为研究对象对中国大陆11个流行地区日本血吸虫虫株进行了扩增、测序。用ClustalⅩ1.81程序对序列进行比对,然后用Paup 4.0程序的MP法和NJ法及PUZZLE 4.1程序的ML法重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系;同时利用DNAS-tar 5.0中的Megalign程序进行相似性、碱基组成、转换、颠换分析。结果显示,对11个流行区的日本血吸虫PCR扩增后获得419 bpcytb部分序列,检测到7个变异位点,变异率为1.67%。种系发育关系分析发现,依据cytb基因可有效地区分我国日本血吸虫山区和湖区两种流行类型,显示种内遗传变异特点,并可将日本血吸虫与分体科的其他吸虫鉴别开来。因此,日本血吸虫cytb基因适合作为日本血吸虫分离株种系发育的遗传标记,也可以作为一种鉴别基因用于分体科吸虫的PCR鉴别诊断。

人源隐孢子虫分离株种类鉴定与种系发育关系分析

目的确定郑州某医院分离到1株隐孢子虫(PRHN)所属种/基因型。方法用PCR对该分离株18S rRNA、HSP70、Cpn60和AOX进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,扩增序列经用DNAstar和ClustalX与GenBank参考序列比对,用PAUP4.0构建种系发育进化树,以确定该分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。结果通过18S rRNA、HSP70基因分析该分离株与Cryptosporidium parvum(C.parvum)鼠基因型同源性最高,分别为99.9%和99.2%,在种系发育树上,PRHN均与C.parvum鼠基因型亲缘关系最近;对Chaperponin 60(Cpn60)和Alternative oxidase(AOX)进行序列分析时,该分离株与本实验室分离到的猪隐孢子虫(C.suis)亲缘关系最近。结论该分离株为C.parvum鼠基因型。

湖南省山羊脑多头蚴的线粒体nad1和nad4基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位4基因(nad4)部分序列(pnad4)的遗传变异情况,并用pnad1和pnad4序列重构脑多头蚴与其它带科绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1和pnad4,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得的pnad1和pnad4序列长度分别均为666和887bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝。由于脑多头蚴pnad1和pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础。

鲁道夫对盲囊线虫C新种的ITS rDNA序列测定及种系发育关系分析

以鲁道夫对盲囊线虫C种为研究对象,对其rDNA的内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增、测序和序列分析,以ClustalⅩ1.81程序对序列进行比对,然后用MEGA4.0程序的MP法和NJ法及PUZ-ZLE4.1程序的ML法构建鲁道夫对盲囊线虫A、B、C种以及北方对盲囊线虫的种系发育关系。结果显示,鲁道夫对盲囊线虫C种的ITS-1,5.8 S,ITS-2序列大小分别为451 bp、127 bp和277 bp,鲁道夫对盲囊线虫3个种与北方对盲囊线虫ITS序列种内差异小,种间差异明显。种系发育关系分析发现,这3种方法(NJ法、MP法和ML法)构建的种系发育树的拓扑结构基本一致,其中C种和A种聚在一起,构成一支,再和B种聚在一起;北方对盲囊线虫单独成一支。研究结果证明鲁道夫对盲囊线虫C种确为一新种。

基于nad5基因分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系

为分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系,本研究利用PCR对黑斑蛙裂头蚴湖南省分离株线粒体DNA烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列进行扩增和测序,分析其遗传变异情况。并利用软件Clustal X 2.0对其序列进行分析,研究黑斑蛙裂头蚴与其它绦虫的种群遗传关系。测序结果显示,所扩增的nad5部分序列长度一致,均为510 bp,湖南省各分离株之间相应序列的相似性在97%以上,湖南分离株与基因库中其它裂头蚴nad5序列的相似度均低于89%。由于黑斑蛙裂头蚴nad5序列种内相对保守,种间差异较大,因此可以作为黑斑蛙裂头蚴种间遗传变异研究的分子标记,从而为黑斑蛙裂头蚴的分子流行病学和进一步的分类鉴定奠定了基础。

扫描电镜观察猴体内寄生的蛇舌状虫属若虫及基于其18S rRNA基因的种系发育关系分析

目的运用扫描电镜观察食蟹猴(Macaca fascicularis)体内分离的蛇舌状虫属若虫虫体表面的超微结构,并基于其18S rRNA序列分析其分子种系发育关系。方法将从食蟹猴分离的蛇舌状虫属若虫用戊二醛与锇酸双固定法,置于扫描电镜下观察其体表超微结构。PCR扩增若虫18S rRNA基因并测序;运用序列比对软件ClustalX 1.83将测序结果与GenBank上所有已登录的孔头舌虫目(Porocephalida)内部虫种序列进行多重比对分析,并使用MEGA 4.0采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。结果扫描电镜示,若虫呈圆柱状,前段略粗,末端变细。腹环由前向后逐渐增宽,至12～13腹环时趋于等宽,腹环与腹环之间,在前半段连接紧密,在后半段有一定间隔。头部腹面正中为口,呈圆形,口稍上方两侧各见一对钩,钩几乎在同一平行线上。两外侧钩的正下方,头胸部最后一节胸环上各有一个对称的大型感觉乳突,紧接的第一节腹环靠中线处有一对呈对称的大型感觉乳突,腹环数目由此算起共29个腹环(末端有2个腹面未连接的不完整腹环不计算在内)。若虫全身布满类圆形的感觉乳突,但在头部背面与末节腹面未见有此类乳突出现。末端腹面有一块状隆起上可见肛门开口。参照文献,暂将该若虫定为串珠蛇舌状虫(Armillifer moniliformis)的若虫。PCR测序后获得18S rRNA部分基因序列,长度为1 836 bp,提交GenBank后获得登录号为HM048870。种系发育树显示其与尖吻蝮蛇舌状虫(A.agkistrodontis)和腕带蛇舌状虫(A.armillatus)构成自展值为95%的分支。前两者又构成一个独立的自展值为75%的分支。结论自食蟹猴体内分离的蛇舌状虫属若虫暂定为串珠蛇舌状虫若虫。

基于cox1基因序列分析山羊褐黄血蜱种系发育关系

为分析山羊褐黄血蜱分离株的线粒体(mt DNA)部分序列(pcox1)的遗传变异情况,并利用cox1序列分析山羊褐黄血蜱与其它蜱的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增山羊褐黄血蜱的部分cox1片段,并对其进行测序分析。结果显示16株山羊褐黄血蜱分离株的cox1序列长度均为800 bp左右,且分离株与基因库中褐黄血蜱位于同一分支,与其它蜱类得到了很好的鉴别。本研究表明pcox1序列种内相对保守,种间差异较大,可作为山羊褐黄血蜱的种间遗传变异研究的分子遗传标记。

贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

目的对贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株进行分子鉴定及种系发育关系的分析。方法采集贵州安顺地区4种常见野生蛇（王锦蛇、乌梢蛇、黑眉锦蛇、灰鼠蛇）来源的裂头蚴,分别提取各裂头蚴基因组DNA,PCR扩增ITS1和cox1基因,所得PCR扩增产物经纯化并T-A克隆后测序。运用ClustalX1.81生物分析软件,将所得序列与GenBank所录迭宫属绦虫和其它属绦虫基因序列进行多重序列比对分析,并应用软件MEGA 6.0构建系统发育树（邻位连接法）。结果成功扩增出8株裂头蚴的ITS1和cox1基因序列,ITS1大小为822～863bp,cox1大小为404～415bp,与预期的基因片段大小一致。基于ITS1和cox1基因序列构建的种系发育树与所有的猬迭宫绦虫均构成同一亚群,总分支的自展值高于50%,二者在不同的分离株之间呈现基因多态性。对8株裂头蚴ITS1和cox1序列的同源性进行比较,ITS1的同源性为70.27%～82.84%,而cox1的同源性为95.63%～99.50%,显示cox1的同源性高于ITS1。已向GenBank提交ITS1和cox1新序列各一条,登录号分别为KF990161和KJ418421。结论贵州安顺地区不同蛇源裂头蚴分离株之间存在基因多态性。从总分支的自展值来看,cox1比ITS1更适合用于种内遗传多态性研究,ITS1适合做定种的分子标记。

基于nad5基因分析白狮蛔虫种系发育关系

为分析白狮蛔虫湖南动物园分离株线粒体nad5的遗传差异,并利用nad5序列分析白狮蛔虫与其他蛔虫的种系遗传关系,应用PCR技术对白狮蛔虫线粒体nad5的部分序列进行克隆和序列测定,利用Clustal X2.0程序对测序所得序列进行比对,再运用Mega4.1程序进行NJ法绘制种系发育树。结果表明:所获得nad5序列长度基本一致,约530 bp,15个样品分离株之间的同源性为97.4%~99.8%,通过构建系统种系发育,结果显示15个白狮蛔虫分离株与狮弓蛔虫位于同一大分支,与其他蛔虫所属分支具有较远的距离,得到较为明显的鉴别。狮弓蛔虫nad5序列种内较为保守,但种间差异明显,nad5基因可以作为理想的分子标记应用于狮弓蛔虫的分子鉴定和种间遗传变异研究,从而为狮弓蛔虫的群体遗传研究奠定基础。

四川省山羊多头蚴线粒体cox2基因序列测定及种系发育分析

应用线粒体细胞色素氧化酶第Ⅱ亚基（cox2）基因作为分子标记，对四川省12个山羊源多头蚴样品的cox2基因部分序列（pcox2）进行PCR扩增，分析其种内变异并重建系统进化树。序列分析结果显示所获得的pcox2序列长度为531 bp，共检测到8个变异位点，变异率为0~1.3%。基于pcox2序列构建的系统进化树显示多头蚴四川分离株与已知多头带绦虫位于同一分支，且脑源和肌间多头蚴聚在一起，均为多头带绦虫。结果表明，多头蚴cox2基因种内存在一定的遗传差异，但种内相对保守，与带属其他绦虫种间差异较大，故可作为多头带绦虫种间遗传变异研究的分子标记。这一研究结果也为山羊多头蚴病的分子诊断奠定了基础。

用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系

本试验以编码线粒体功能性蛋白Chaperonin 60（CPN60）的核基因作为研究对象,对隐孢子虫分离株CPN60基因进行扩增测序,用Clustal X1.81对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,然后用PAUP4.0程序中邻接法（Neighbor-joining,NJ）、最大简约法（Parsimony,MP）构建基因树,同时用TREEPUZZLE程序Version4.1构建最大似然树（Maximum likelihood,ML）,以确定不同隐孢子虫虫株之间的进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构建的进化树作参照,评价CPN60是否更适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系的分子标记。结果显示：基于CPN60构建的进化树将隐孢子虫分为两大类：C.baileyi和C.meleagridis处于一个分枝,C.hominis、C.suis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于96%-100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此,CPN60基因序列也可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。

钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列测定及其种系发育分析

本试验将从犬猫肠道中分离的钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征;PCR扩增其ITS2基因序列并测序,并将测序结果与GenBank同属异形科的多棘单睾吸虫和横川后殖吸虫序列进行比对;应用Mega 6.05软件采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。盐酸卡红染色后显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫各形态学特征符合经典的分类学描述。PCR测序后获得钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列长度分别为295和297bp,G＋C含量分别为49.5%（146/295）和54.2%（161/297）。提交至GenBank后获得登录号分别为钩棘单睾吸虫KJ137221-KJ137223,KP165437-KP165439;扇棘单睾吸虫KP165440。序列比对结果显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫种内差异性为0,4种异形吸虫种间差异为15.2%-28.9%。基于ITS2序列建立的种系发育树显示钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫构成自展值为78%的拓扑分支。