汉坦病毒M、S基因分型及种系进化分析

目的探讨湖南省肾综合征出血热(HFRS)患者及宿主动物黑线姬鼠携带汉坦病毒的基因型别及序列特征。方法应用免疫荧光试验(IFA)对鼠肺标本进行粗筛,提取IFA阳性鼠肺组织及HFRS患者血清总RNA,设计汉坦病毒M、S基因特异性引物,应用RT-PCR技术进行扩增,回收阳性扩增产物并克隆到pMD-18T载体进行序列测定,将所测序列与国内外HTNV及SEOV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,应用MEGA5.0.4软件构建M、S基因种系进化树。结果 IFA阳性鼠肺标本荧光显微镜下可见散在的黄绿色针尖大小样颗粒;RT-PCR法扩增汉坦病毒M、S基因,HTNV通用引物可见490bp与593bp的阳性条带;阳性产物进一步应用HTNV分型引物进行M、S基因检测,分别扩增出一约242bp与276bp大小的条带;SEO型特异性M、S基因片段内侧引物扩增反应均为阴性;编号为Hunan01、Hunan02、Hunan03的M、S基因序列与HTNV型84FLi株、SN7株的同源性最高,与SEOV型Gou3株的同源性最低;种系进化分析表明,Hunan01、Hunan02、Hu-nan03为汉坦病毒H5亚型。结论湖南省存在HTNV型感染病例与宿主动物,基因分型技术能进一步对病毒亚型进行鉴定。

基于ITS基因分析蛇源裂头蚴种系进化关系

为了研究蛇源裂头蚴种系发育关系,本研究对大王蛇裂头蚴湖南株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)进行扩增与测序,并对其基因序列进行比对后绘制种系进化树,分析蛇源裂头蚴与其它带科绦虫的种群遗传关系。结果显示,12个蛇源裂头蚴分离株ITS基因序列长度差异较小,为1 386 bp^1 404 bp;各分离株之间ITS-1和ITS-2差异分别为0.2%~1.3%和0.4%~2.2%,与Gen Bank中登录的其它带科绦虫相比,同源性均分别低于66.3%和52.1%。表明蛇源裂头蚴ITS基因序列在种内相对保守,种间差异较大,可以作为蛇源裂头蚴的分子遗传标记。分离株系统进化树显示,所有分离株与欧猬迭宫绦虫位于同一大分支,与其他带科绦虫得到了很好的鉴别。本研究为蛇源裂头蚴的鉴别诊断、分子流行病学调查等方面的研究奠定基础。

红河州HIV/HCV合并感染者HCV基因亚型多样性及种系进化研究

目的探讨云南省红河州地区HIV/HCV合并感染者HCV基因亚型多样性及种系进化情况,为本地区HIV/HCV合并感染者合理的抗病毒治疗提供科学依据,同时监测该类患者体内的HCV是否存在遗传进化的新变异。方法扩增55名红河州内HIV/HCV合并感染的HCV病毒载量阳性的丙型肝炎患者C/E1和NS5B 2个基因位点,通过测序分析和种系进化分析以明确研究对象所感染的HCV病毒的基因型和亚型。结果综合2个外显子序列分析,结果显示红河州HIV/HCV合并感染患者的HCV以3b亚型最多见(40.0%),其次是3a(20.0%)、6a(16.4%)、6n(12.7%)、1b(9.1%)、双重感染(1.8%)。课题组做本地区HCV基因亚型遗传进化分析时发现红河州地区流行的6a亚型毒株序列均与越南的HCV 6a亚型毒株的参考序列丛集。结论 HCV 6a亚型是越南和红河州内静脉吸毒人群(intravenous drug uses,IDUs)中高流行的病毒亚型,由于与越南接壤,红河州可能是HCV 6a亚型通过静脉吸毒途径由越南传入中国流行的一个传入点,进而再传入昆明或中国的其它地区。

一株致普通棉耳狨猴严重下呼吸道感染的副粘病毒种系进化分析

目的探讨副粘病毒Tianjin株的种系进化地位。方法将副粘病毒Tianjin株HN核苷酸、氨基酸序列与GenBank发布的副粘病毒相应序列进行比较,构建种系进化树,阐明副粘病毒Tianjin株在副粘病毒科中的分类地位。结果基于HN核苷酸序列的种系进化分析表明,副粘病毒Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒亲缘关系最近。Tianjin株与仙台病毒BB1株HN核苷酸、氨基酸序列同源性分别为94.8%、95.1%,与其他仙台病毒,在84.8%～88.7%和89.6%～91.7%之间。Tianjin株与BB1株HN核苷酸序列的差异明显大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异。Tianjin株HN蛋白存在18个独特的氨基酸残基变异。结论结合种系进化分析结果、病毒的宿主来源和致病特点,提示副粘病毒Tianjin株不属于仙台病毒现有的3个进化分支而自成独立的一支。

2007-2010年湖南省肾综合征出血热监测及病毒种系进化分析

目的分析2007-2010年湖南省肾综合征出血热(HFRS)的流行特征及病毒基因的分型与种系进化。方法对2007-2010年湖南省传染病监测信息报告管理系统网络直报的HFRS病例资料及疫情监测资料运用描述性流行病学方法对人间与啮齿类动物间的疫情进行分析和比较,应用免疫荧光试验(IFA)、RT-PCR技术对HFRS病例血清样本及鼠肺组织样本进行病原学检测,对病毒M基因特征进行生物信息学分析。结果 4年间14地市(州)共报告HFRS病例2 115例,病死率为1.28%;疫情主要分布在湘中的娄底和邵阳地区,农民占67.19%;共布鼠夹55 289次,捕鼠2 316只,鼠肺组织总带毒率为2.18%;疫区类型为姬鼠型为主的混合型;2份HFRS患者血清及1份鼠肺组织HTNV特异性引物与分型引物RT-PCR扩增为阳性;病毒在进化上与84Fli株在同一组内,核苷酸序列高度同源;3株病毒均为HTNV型、H5亚型病毒株。结论近年来湖南省HFRS发病率和死亡率总体呈现下降趋势,受某些因素的影响,局部地区疫情相对较严重;病毒M基因同国内其他毒株比较,未发生较大变异。

基于全基因组比较的SARS冠状病毒种系进化分析

SARS(severe acute respiratory syndrome)冠状病毒已被世界卫生组织确认为SARS传染病的病原体,它的全基因组测序工作分别由中国、加拿大、美国等国的研究小组完成。然而它的起源仍是一个谜为了探寻SARS冠状病毒的来源,基于FDOD(function of degree of disagreement)方法,对12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒进行了全基因组比较,构造出种系进化无根树。结果表明,这两类病毒(分别由12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒构成)虽然都来自冠状病毒属,但它们位于两个不同的进化分支上。冠状病毒属中的3个组被准确地重构。根据得到的结果,推测SARS冠状病毒更类似于第一组中的冠状病毒。根据种系进化树的拓扑结构和各SARS冠状病毒分离株与造成香港Metropole饭店疫情的SARS冠状病毒株之间的联系,推测各SARS冠状病毒分离株分别位于进化树上两个大的分支,这为SARS的流行病学研究提供了辅助信息。

一例麻疹病例的实验室确诊及病毒种系进化分析

目的对一例疑似麻疹病例进行实验室诊断,同时对病毒种系进化进行分析。方法应用Measles IgM试剂盒(μ-capture)对疑似患者血清进行病毒IgM抗体的检测,采集咽拭子标本,提取总RNA,合成麻疹病毒核蛋白基因特异性扩增引物,应用RT-PCR及Real-time PCR进行扩增,回收阳性扩增产物,进行序列测定,将所测序列与国内外麻疹病毒株序列进行核苷酸同源性分析,应用MEGA5.0软件构建核蛋白基因种系进化树。结果疑似病例血清麻疹病毒IgM抗体为阳性;RT-PCR法扩增病毒核蛋白基因可见一约330bp大小的条带;与Genbank报道的国内Mvi Hunanstrain 1、MviHunan strain 2、MviHunan strain 3的同源性最高;种系进化分析表明MviHunan Yueyang strain同所有H1型的麻疹病毒聚集在进化树的B组内,为麻疹病毒H型H1亚型。结论分离的病毒为麻疹病毒H1型,基因分型技术能进一步对病毒亚型进行鉴定。

黑麂线粒体基因组序列分析

采用PCR产物直接测序方法测定了黑麂线粒体基因组全序列 ,初步分析了其基因组特点并定位了各基因的位置 .结果显示 :黑麂的线粒体基因组全序列长度为 1 6 35 7bp ,可编码 2 2种tRNA、2种rRNA、1 3种蛋白质 ,碱基组成及基因位置与小麂、赤麂和其它哺乳类动物的线粒体基因组相似 ;模拟电子酶切图谱与先前的报道基本一致 ;基于细胞色素b的全基因序列 ,分别以最大简约法、N J法、最大似然数法与其它 1 4种鹿类动物的相应序列进行了聚类分析 ,构建出相似的系统进化树 :初步确定了麂亚科动物在鹿科中处于与鹿亚科、北美鹿亚科并列的进化地位 .在此基础上 ,进一步以黑麂、赤麂、小麂的线粒体编码RNA和编码蛋白质的基因序列构建系统进化树 ,分析了三者的亲缘关系 .结果表明 :黑麂和赤麂亲缘关系较近 ,是较新的物种 。

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.

柯萨奇B3病毒VP1基因序列及系统发生树分析

目的研究柯萨奇B组3型病毒MKP株结构蛋白VP1基因序列及变异性。方法在Hela细胞中增殖病毒,应用RT-PCR扩增目的基因片段,与pMD18-T载体连接,鉴定后测序,进行序列同源性及系统发生分析。结果CVB3/MKP株VP1基因含930个碱基,编码310个氨基酸,与其他参考株比,核苷酸同源性在82.50%以上,氨基酸同源性在95.47%以上,CVB3/MKP株VP1基因与Nancy株聚簇。结论CVB3/MKP株VP1基因与Nancy株在进化上属同一分支。CVB3/MKP株与CVB3/P株在系统发生树中的距离最近。

基于无患子科ITS序列探讨龙荔的系统发育

【目的】利用无患子科间隔转录区序列(ITS)探讨了龙荔的系统发育地位。【方法】通过无患子科27个属62个种ITS序列信息序列比对和系统发育分析,探讨龙荔和龙眼、荔枝之间的系统进化关系。【结果】基于ITS序列信息可以清楚区分无患子科内不同的种属,其属间ITS序列相似度为(91.0±4.4)%、种间为(96.3±2.8)%。龙荔与龙眼、荔枝之间的ITS序列同源性均为92%,低于龙眼与荔枝间的同源性(93%),但高于和红毛丹的同源性(91%),其ITS序列中有4.5%的碱基位点与龙眼和荔枝均不同,主要表现为T和C互换、A和G互换,共占序列差异位点的56.5%。以韶子属红毛丹为外类群的系统发育树显示,龙荔、荔枝、龙眼之间的进化发育明显,龙荔最早自成分支,其次是荔枝,最后是龙眼。【结论】ITS序列信息分析结果支持龙荔作为独立属的分类可能。

猕猴细胞免疫功能检测的研究进展

猕猴在进化上与人类非常接近,其免疫系统与人极为相似,因此在病原微生物感染模型、器官移植、药物和免疫制剂检定以及人类免疫疾病的实验研究中的应用越来越广。本文综述猕猴细胞免疫功能检测的研究进展,为猕猴用于免疫学研究提供一些重要的检测指标。一、猕猴淋巴细胞的表型、亚群及功能1.抗人淋巴细胞抗体与猕猴淋巴细胞的交叉反应目前,还没有建立系统的抗猕猴淋巴细胞表面标志的抗体系统,但许多抗人淋巴细胞表面标志的抗体与猕猴的淋巴细胞有不同程度的交叉反应（表1）,包括识别T细胞的抗CD4、CD8、CD25抗体和识别B细胞的抗CD19、CD20抗体的大部分。在种系进化过程中保存下来的这些表面标志,很可能具有某种重要的功能,并在人。

“生命的生产”、黑猩猩与艺术的起源

人,是一种有自由生命的类存在物。人的自由的生命活动,首先在于他的“生命的生产”。“生命的生产”在种系进化过程中有着显见的持续性,因此,本文认为必须以此为逻辑起点和核心概念,从文化人类学和比较心理学的角度对艺术起源进行探讨.本文将首先揭橥“劳动说”理论偏颇之所在;然后根据劳动的两种不同形态,提出必须到“萌芽状态”的劳动中去寻找“萌芽状态”的艺术之命题。笔者认为,“艺术的起源”与“劳动的起源”和“人类的起源”是同步发生的,而研究三者最理想的活化石便是黑猩猩。因此。

常见的不良护理心理分析

常见的不良心理，往往不受法律和现行制度的制约，有时可受到良心和道德的谴责。是一种潜在的，无形的，有时甚至是惰性的，每时每刻都可能左右人们的言行，且以其外观的合法倾向，掩饰其内在的不良性。一旦潜入到意识中来，就可能导致不良后果。这种不良后果有时呈隐性，有时呈显性。它以人类在种系进化过程中，残留习惯和狭隘的个人主义及内容是多变的，多与自身利益相联系，又可随着其它变量的变化而修正。所不同的是，视其是否占主导地位而已。本文所论及的仅侧重临床护理。

2006～2008年B型流感病毒泰山分离株血凝素基因序列分析

目的分析泰安市2006~2008年度分离的B型流感病毒HA1基因序列,探究其基因变异特点及种系进化分布,为流感防治提供技术支持。方法采集监测医院流感样病例鼻、咽拭子标本,分离流感病毒并进行型别鉴定,选取部分B型流感病毒株提取病毒RNA,采用逆转录-聚合酶链反应扩增血凝素基因,扩增产物经纯化后进行血凝素基因HAl区核苷酸序列测定并推导编码的氨基酸序列,然后用DNAsTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果 2006/2007年度分离的B型流感病毒均为Victroria系;2007/2008年度以Yamagata系为优势株,也有少量Victroria系活动。与B/Shanghai/361/2002/2和B/Tianjin/144/05比较,Yamagata系泰山分离株HA氨基酸替换数为8~10个,所有毒株均在7~9个相同氨基酸位点发生了相同替换;与疫苗推荐株B/Malaysia/2506/2004比较,Vic-troria系泰山分离株氨基酸替换数为2~3个,所有毒株均在HA2个相同氨基酸位点发生了相同替换。结论 Yama-gata系泰山分离株HA1基因特性已发生改变,从基因水平说明当地Yamagata系流行株抗原发生了变异;Victroria系分离株基因特性虽有所改变,但是否已成为有流行病学意义的变异株,尚有待进一步观察。2006/2007年度流感疫苗对当地B型流感应有一定预防作用,2007/2008年度疫苗对B型流感的预防效果欠佳。

奶牛乳房炎致病大肠埃希菌的分型及外膜蛋白酶OmpT的抗原性验证

目的对奶牛乳房炎致病大肠埃希菌(E.coli)进行分型及外膜蛋白酶T(outer membrane protease,OmpT)的抗原性验证。方法采用凝集试验测定黑龙江省分离的84株致病E.coli的O血清型,PCR扩增种系分类群标记基因法对84株E.coli进行分型;经BLAST比对筛选ompT基因后,PCR验证ompT基因的普遍性;克隆A、B1、D群代表株ompT基因,测序后进行同源性比对;构建B1群E.coli 2002-1株ompT基因重组表达质粒pET-32a-ompT,转化E.coliRosetta,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,Western blot法鉴定重组蛋白的抗原性。结果 84株奶牛乳房炎致病E.coli中共鉴定出血清型51株,覆盖42个O血清型,归属A种系进化群10株,占11.90%;B1种系进化群74株,占88.10%;无肠外强致病的B2和D群。各型E.coli均可扩增出ompT基因。4亚群代表株ompT基因具有高度保守性,同源性达97%以上。重组表达质粒pET-32a-ompT经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约55 000,诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的29.8%。纯化的重组OmpT蛋白纯度为87.6%,与4亚群E.coli免疫血清均可发生特异性反应。结论种系进化是对奶牛乳房炎致病E.coli分型的理想方法,外膜蛋白酶OmpT在E.coli各种系进化群中抗原性良好,可作为研制E.coli蛋白亚单位疫苗的候选抗原。

ITS/CHS1靶位序列分析结合SRAP分子标记技术鉴定Nannizzia incurvata临床分离株

以转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和几丁质合成酶1(chitinase synthase 1,CHS1)为鉴定靶位,结合种系进化分析将2007年至2016年分离自头癣或面癣患儿的12株石膏样小孢子菌复合体成员(现被归入Nannizzia菌属)鉴定到种水平,其中5株为Nannizzia gypsea(Microsporum gypseum),另7株为Nannizzia incurvata(Microsporum incurvatum)。在此基础上,通过序列相关扩增多态性(SRAP)分子标记进一步证实二者在DNA多位点存在扩增多态性。本研究证实在我国湖北地区存在Nannizzia incurvata,为我国开展Nannizzia菌属的分子流行病学研究提供了实验室依据和支持。

湖南省实验动物病毒感染现况分析

目的对实验动物病毒感染状况进行抽样检测与评估。方法对湖南省相关生产及使用实验动物的机构进行大鼠、小鼠随机抽样,应用ELISA法进行大鼠汉坦病毒、大鼠仙台病毒、小鼠仙台病毒、小鼠鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒的抗体检测,应用Real-timePCR进行肠道病毒71、柯萨奇病毒A16及轮状病毒的核酸检测,设计特异性汉坦病毒M基因扩增引物,应用聚合酶链式反应(PCR)进行汉坦病毒核酸检测,对阳性产物进行基因序列测定,应用生物信息学方法,通过分子进化分析确定病毒的型别。结果 56份大鼠血清标本汉坦病毒及仙台病毒抗体检测为阴性;135份小鼠血清标本仙台病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒的抗体检测结果均为阴性:189份大鼠小鼠血液标本肠道病毒71、柯萨奇病毒A16及轮状病毒的核酸检测均为阴性,1份SD大鼠血液标本汉坦病毒M基因PCR扩增结果为阳性,产物大小约860 bp,测序产物经BIAST序列比对,初步确定为汉坦病毒,进一步分子进化分析表明为汉坦病毒HTN型,与汉坦病毒疫苗株Z10株比较,核苷酸同源性为86%,氨基酸同源性为89%。结论湖南省实验动物存在汉坦病毒HTN型感染,应及时对实验动物进行免疫接种及从业人员健康体检。

河北省甲型H_1N_1流行性感冒病毒血凝素基因特征研究

目的掌握河北省甲型H1N1流行性感冒(甲流)病毒的流行情况;对分离到的甲流病毒株血凝素(Hemagglutinin,HA)基因序列进行测定比较,分析HA重链区(HA1)第222位氨基酸位点的突变情况。此位点编码的天冬氨酸(Aspartic Acid,N)突变为甘氨酸(Glycine,G)(D222G),可能会使病毒更容易结合下呼吸道受体,为流感大流行的预防控制提供参考。方法采集流感样病例的鼻咽拭子,用狗肾传代细胞分离流感病毒,经血凝抑制试验鉴定分型。选取不同时间、地域的10株甲流病毒进行HA基因全序列分析,167株病毒测HA区379～1204片段,用DNA(脱氧核糖核酸,Deoxyribonucleic Acid)Star软件比较分析同源性、变异趋势。结果 10株甲流病毒毒株HA基因与疫苗株A(甲)/California(加利福尼亚)/07/2009相比高度同源,核苷酸同源性为98.9%～99.5%,氨基酸同源性为98.4%～99.3%,有3个位点氨基酸发生同样的替换(脯氨酸,Proline)100S(丝氨酸,Serine),S220T(苏氨酸,Threonine),E(谷氨酸,Glutamic Acid)391K(赖氨酸,Lysine)。从采集于2010年12月标本分离的2株甲流病毒A/河北桥东/SWL(Swine-like)178/2010和A/河北裕华/SWL1261/2010,在202、214、468三个氨基酸位点与其他毒株不同。所有167株甲流病毒的HA1第222位氨基酸均未发生D222G突变。结论河北省甲流病毒HA基因与疫苗株A/California/07/2009高度同源,与疫苗株及各毒株之间核苷酸同源性均≥98.9%,尚未发现D222G变异。