慢速程序冷冻对透明带显微操作后人类胚胎冻存率及发育的影响

【目的】探讨慢速程序冷冻对透明带显微操作后胚胎冻存率及继续发育的影响。【方法】将 96个Ⅱ级以上人类多精受精胚胎随机分为单纯透明带打孔组 (n =2 4) ,胚胎活检组 (n =40 )及对照组 (n =32 )。为模拟临床种植前诊断活检后胚胎冷冻过程 ,将透明带显微操作后胚胎继续培养 6～ 10h再进行慢速程序冷冻 ,观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及胚胎继续发育能力。【结果】活检及透明带打孔后冻融胚胎中发生裂解的卵裂球多位于透明带破口附近。活检组胚胎完整率、胚胎存活率及卵裂球存活率分别为 10 % ,2 5 0 %和 2 9 0 % ,较对照组 (4 3 7% ,6 6 0 %和 6 2 4% )明显降低 (P <0 0 1)。虽然单纯透明带打孔组冷冻后胚胎完整率及胚胎存活率与活检组无明显差异 ,但卵裂球存活率较胚胎活检组高 (分别为 40 9%和 2 9 0 % ) (P<0 0 1) ,以上各组存活胚胎继续发育率差异无显著性 (P>0 0 5 )。【结论】以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂的人类分裂期胚胎慢速冷冻程序并不适用于化学法透明带打孔活检胚胎的冷冻保存 。

液氮蒸汽法、程序冷冻法冷冻精子复苏后活动能力比较

目的比较液氮蒸汽法和程序冷冻法冷冻保存的人类精子复苏后的活动能力。方法在同一种冷冻保护剂作用下,分别采用液氮蒸汽法和程序冷冻法对79份精液标本进行冷冻,比较复苏后精子的活动力。结果液氮蒸汽法冷冻的标本复苏后前向活动精子百分率和总活动率分别为43.2%±7.7%、52.2%±9.6%,用程序冷冻法冷冻者分别为44.2%±3.5%、52.9%±4.9%,两组相比,P均>0.05;但与冷冻前的58.2%±5.6%、65.6%±5.7%相比均明显下降,P均<0.05。结论采用液氮蒸汽法和程序冷冻法冷冻的人类精子复苏后活动能力相似,两种方法均可以用于常规的精子冷冻。

程序冷冻法、液氮蒸汽法冷冻人类精子的效果比较

目的:比较程序冷冻法和液氮蒸汽法冷冻保存人类精子的效果。方法:用同一批次GYC型冷冻保护剂,分别应用程序冷冻法和液氮蒸汽法对68份精液标本进行冷冻保存,并比较其冷冻复苏率。结果:应用程序冷冻法冷冻的精液标本,其复苏后前向运动精子(a+b级)的冷冻复苏率为66.7%±8.1%,应用液氮蒸汽法冷冻的精液标本,其复苏后前向运动精子(a+b级)的冷冻复苏率为63.9%±7.9%,两组相比无显著差异(P>0.05)。结论:采用程序冷冻法和液氮蒸汽法冷冻人类精子,二者冷冻复苏率无显著差异,两种方法均可以用于人类精子库冷冻保存精液标本。

玻璃化冷冻及程序冷冻对人卵巢组织卵泡活性的影响

目的:比较玻璃化冷冻及程序冷冻对人卵巢组织卵泡活性的影响。方法:将15例人卵巢组织20 min内运至实验室,切割成1 mm×5 mm×5 mm大小的卵巢皮质片,随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组及程序冷冻组。玻璃化冷冻组及程序冷冻组均采用优化的实验方法进行。新鲜及复苏组织体外培养后,在光镜及电镜下分析卵泡的形态正常率,采用激素释放试验及异体移植试验检测冷冻复苏的人卵巢组织的功能,并与新鲜组比较。结果:冷冻复苏组及新鲜对照组卵巢组织皮质内均可见形态正常和异常的始基及初级卵泡,新鲜对照组卵泡形态正常率显著高于玻璃化冷冻组和程序冷冻组(P<0.05);程序冷冻组形态正常率稍高于玻璃化冷冻组(P>0.05)。3组均可见超微结构正常及异常的原始卵泡、初级卵泡。卵巢皮质片体外培养后持续分泌雌二醇和孕酮。新鲜组激素分泌水平高于玻璃化冷冻组和程序冷冻组,但差异无统计学意义(P>0.05)。异体移植试验显示,程序冷冻组较玻璃化冷冻组具有更高的移植物回收数及卵泡密度。结论:由于程序冷冻人卵巢组织卵泡具有较高的发育潜能,因此其较玻璃化冷冻更有应用前景。

程序冷冻法冷冻精子进行IVF-ET的临床结局分析

目的:探讨程序冷冻法冷冻精子在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的临床结局及安全性。方法:回顾分析在本中心进行IVF-ET治疗的不孕夫妇的372个周期,分为4个组:用程序冷冻法冷冻精子行常规IVF共76个周期(A组),程序冷冻法冷冻精子行ICSI共92个周期(B组),同期新鲜精液行常规IVF周期97例(C组),新鲜精液行ICSI周期107例(D组),分别比较A组与C组、B组与D组的正常受精率、异常受精率、卵裂率、优质胚胎率、妊娠率、种植率、流产率、多胎率和畸形率。结果:与新鲜精液IVFET组相比较,程序冷冻法冷冻精子常规IVF组及ICSI组的正常受精率、异常受精率、卵裂率、妊娠率、种植率、流产率、多胎率和畸形率等方面差异无统计学意义(P>0.05);但冷冻精子行ICSI组与新鲜精子行ICSI比较,优质胚胎率低且有统计学意义(P<0.05)。结论:用程序冷冻法冷冻精子助孕可以获得与新鲜精子相似的结局,是一种较为安全可靠的精液保存方法,可用于IVF-ET术前精液冷冻保存。

程序冷冻装置及其在低温保存中的应用

近年来,随着低温应用技术的迅速发展,在生物、医学方面已较广泛采用了深低温技术。经低温保存的人皮肤、角膜、血细胞、骨髓和胎肝细胞等已在临床应用,并取得了较好的效果。对各种生物材料(包括细胞、组织器官、生物体等)低温保存的研究表明,欲获得较高的生物活性。

液氮直投及程序冷冻冻存人卵巢组织的研究

目的 液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织效果的比较研究.方法 采用液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织,解冻后苏木素-伊红染色检测冷冻前后各级卵泡（始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡）的组织形态,然后将卵巢组织体外培养3天,检测培养上清雌激素水平.结果 液氮直投法、程序冷冻法始基卵泡形态正常率分别为72.96%、81.87%,差异有统计学意义（χ2=11.27,P〈0.05）;初级卵泡形态正常率分别为58.62%、34.48%,差异有统计学意义（χ2=6.79,P〈0.05）.第3天、第6天血清雌激素水平检测,液氮直投法与程序冷冻法比较差异无统计学意义（108.38±9.27 vs 105.15±9.13,151.08±16.64 vs 147.38±20.48,均P〉0.05）.结论 程序冷冻法以及液氮直投法可有效保存卵巢组织,对卵巢组织和功能的影响较小,而且液氮直投法操作更简便、快捷.

玻璃化冷冻及慢速程序化冷冻对未成熟睾丸组织的保护效果分析

目的:探究比较目前常见主流睾丸组织冷冻方法学,即玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻,筛选适宜的睾丸组织冷冻方法。方法:分别收集3周龄小鼠及<2岁龄青春期前食蟹猴的睾丸组织,将其剪碎至6~26 mm^(3),均分为3组:新鲜组、玻璃化冷冻组和慢速程序化冷冻组,在冷冻5~7 d后复苏冷冻睾丸组织,使用HE染色、免疫荧光染色、TUNEL染色和Western印迹对冷冻-复苏睾丸组织进行评估。结果:①在C57BL6/J小鼠睾丸组织中,慢速程序化冷冻组精原干细胞标志物UCHL1表达量高于玻璃化冷冻组,凋亡细胞(TUNEL+细胞)含量低于玻璃化冷冻组。②食蟹猴睾丸组织中,慢速程序化冷冻组精原干细胞标志物UCHL1、细胞增殖标志物PCNA的表达量高于玻璃化冷冻组。结论:玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻均可成功保存青春期前未成熟的小鼠及食蟹猴睾丸组织。但是在玻璃化冷冻保存中,对于冻存体积为6~26 mm^(3)的睾丸组织存在更多冷冻损伤区域,可能影响睾丸组织中精原干细胞的冷冻储存效果。

不同冷冻方法对犬精液冷冻效果的影响

精液冷冻保存是种质资源保存利用的重要方法之一,寻找一种廉价、高效的冷冻方法自精液冷冻技术诞生以来便是人们努力的方向。目前精液冷冻主要有三种方法,即程序冷冻、液氮熏蒸和颗粒冷冻。这三种方法各有利弊,本实验将对三种方法冷冻效果做一个对比,以供选择冷冻方法时作为参考。

不同因素对西藏阿旺绵羊胚胎冷冻与移植效果的影响

为探究西藏阿旺绵羊推行胚胎移植及胚胎冷冻技术的可行性,以阿旺绵羊为供体,澳湖羊为受体,探讨发情期内不同月份对阿旺绵羊超排效果的影响、不同发育阶段鲜胚和移植数量对母羊受胎率及产羔率的影响,以及冷冻方法对胚胎移植的影响。结果显示:发情期7月超排组平均可用胚数(3.95±4.23)显著低于10月超排组(5.45±4.03);阿旺绵羊胚胎移植2枚桑椹胚的受体妊娠率最高,达到81.81%,产羔率达57.58%,具有显著性差异;阿旺绵羊胚胎程序化冷冻组受体妊娠率为35.48%,显著优于玻璃化冷冻组受体妊娠率13.63%。以上结果表明,西藏推行阿旺绵羊胚胎移植技术的可行性较高。

鲈鱼胚胎程序化冷冻保存的研究

对鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)胚胎的程序降温冷冻保存进行了研究。通过稀释液的筛选实验 ,选择了一种培养效果好的稀释液DS1液。研究了不同发育阶段胚胎对抗冻液的毒性耐受力 ,表明肌肉效应期胚胎的耐受力最强。测定了心跳期胚胎在抗冻液A1 、A2 、B1 、B2 中的平衡处理时间 ,为进行鲈鱼胚胎冻前平衡提供了参考时间。比较了植冰和不植冰对鲈鱼胚胎冷冻保存结果的影响及不同洗脱方法洗脱胚胎的效果。结果表明 ,在冷冻过程中诱导植冰的胚胎成活率高于未植冰组 ,两步法洗脱效果优于一步法和三步法。用不同降温速率进行了鲈鱼胚胎的超低温冷冻保存实验 ,结果表明 ,采用 1 .5℃ /min的降温速率降温 ,在液氮中冷冻保存 30min的 72粒心跳期胚胎中有 3粒成活 ,成活率为 4.2 %。

人卵巢组织程序化冷冻及体外培养对卵泡活性和雌二醇分泌的影响

目的探讨程序化冷冻保存及组织体外培养对人卵巢皮质内卵泡活性和雌二醇分泌的影响。方法取手术切除的人卵巢皮质组织,修剪成1 cm3大小组织块,采用抽签法随机分为新鲜组、程序冷冻组、新鲜培养组、冻融后培养组。应用程序化冷冻法冻存卵巢组织,冷冻前后分别对卵巢组织进行体外培养,电化学发光免疫分析法检测上清液中雌二醇水平。冷冻前后及培养前后分别用Clacein AM进行卵泡荧光染色,各级卵泡计数。结果①冷冻前后各级卵泡数量及构成比差异无统计学意义(P>0.05);②新鲜组织和冻融组织体外培养都具有持续分泌E2的功能,开始培养阶段冻融组织分泌的雌二醇水平偏低(P<0.05),之后组间上清液雌二醇水平差异无统计学意义(P>0.05);③体外培养前后始基卵泡和初级卵泡数量及其构成比差异无统计学意义(P>0.05);体外培养后次级卵泡数量及构成比增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论程序冷冻法可以较好地保存人卵巢皮质内的窦前卵泡,不影响体外培养的卵巢组织的雌二醇分泌。卵巢组织体外培养情况下,次级卵泡的生长优于始基卵泡和初级卵泡的生长。

程序化冷冻与玻璃化冷冻卵裂期胚胎移植的母婴结局对照分析

目的探讨分析程序化冷冻与玻璃化冷冻卵裂期胚胎复苏周期移植的母婴结局。方法对102例程序化冷冻复苏周期及109例玻璃化冷冻复苏周期进行回顾性分析,比较两组的临床结局及新生儿情况。结果两组患者的一般情况相似;程序化冷冻组和玻璃化冷冻组的胚胎复苏率分别为89.7%和99.6%(P<0.05),两组的临床妊娠率、着床率、活产率分别为56.6%、38.1%、79.2%和54.1%、33.3%、71.2%,差异无统计学意义(P>0.05);两组新生儿的孕周、出生体重、出生缺陷率无显著性差异(P>0.05),玻璃化冷冻组早产率(19.2%)有高于程序化冷冻组早产率(12.3%)的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论玻璃化冷冻显著提高胚胎复苏率,能提高胚胎利用率,程序化冷冻组与玻璃化冷冻组相比拥有相似甚至更好的母婴结局,玻璃化冷冻在成为常规工作之前还需加强对其母婴结局的后续研究及子代的长期随访。

经程序化冷冻的小鼠休眠胚胎的基因表达谱差异分析

目的探讨小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后基因表达谱的变化及相关信号通路的改变趋势。方法采用Affymetrix基因芯片检测小鼠正常休眠胚胎和经程序化冷冻后的休眠胚胎的差异表达基因;采用GO分析和Pathway分析等生物信息学方法进一步了解相关信号通路的改变。结果经程序化冷冻后的小鼠休眠胚胎与正常休眠胚胎相比,存在228个差异表达基因,其中50个基因表达上调,178个基因表达下调。Pathway分析显示黏着斑通路、细胞外基质受体相互作用通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、细胞凋亡通路、细胞通讯通路、泛素介导的蛋白质水解通路、甘油磷脂代谢通路、小细胞肺癌通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等基因差异表达变化趋势明显。结论小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后会导致一系列基因调控变化,并可能影响多条信号通路的协同变化。

藏酋猴精液深低温冻存的研究──不同的冷冻程序、冷冻稀释保存液冻存效果的比较

以存活率（ＳＲ）、复苏运动度（ＲＭ）、ＳＰＡ为精子活力检测指标，对四种冷冻程序ＰＳＦ、Ｈ３Ｐ、ＬＰ、ＭＤＰ和卵黄的、无卵黄的冷冻稀释保存液进行了藏酋猴（Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）精液冻存比较研究。 ＰＳＦ的ＳＲ为９０．１±１．９％，ＲＭ为６３．８±２．８％，显著高于其他三种冷冻程序（Ｐ＜０．０１）。卵黄冷冻稀释保存液（ＭＤＭ）的ＳＲ（９５． ４±１．３％）和ＲＭ（８８．０±１０．２％）显著高于无卵黄防冻液（ＦＣＳ－Ｇ／ＴＨ）的ＳＲ（９０．１±１．９％）和ＲＭ（６３．６±２．８％），但前者在复苏一小时后，ＲＭ（１２．５±１．６％）明显低于后者的ＲＭ（５４． ７±２． ２％）。用 ＦＣＳ～Ｇ／ＴＨ冻存的精液经 ＳＰＡ检测，其穿透率为新鲜精子的 ５１． ９％。结果提示：１）慢速降温冷冻程序适于藏酋猴精液冻存；２）卵黄冷冻稀释保存液能较好地保存藏酋猴精液的活动度；而无卵黄防冻液则有利于延长其冷冻精子的运动寿命。这可能与两者的稀释液及所含的脂蛋白不同有关。

程序化冷冻前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎的Hba-α蛋白分布和差异表达

目的利用程序化冷冻的方法,探究冷冻前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中Hba-α蛋白的分布和差异表达的变化,为今后开发和利用新型哺乳动物源抗冻蛋白提供理论依据。方法从妊娠d5小鼠体内获取孵化囊胚;从小鼠延迟着床模型获取休眠胚胎,利用Confocal显微镜和Western Blot技术对程序化冷冻前、后的各组胚胎进行Hba-α蛋白的分布和表达检测。结果孵化囊胚和休眠胚胎在程序化冷冻前、后均有Hba-α蛋白的表达;孵化囊胚经程序化冷冻后Hba-α蛋白的表达与冷冻前相比差异无显著性(P>0.05);冷冻前休眠胚胎与程序化冷冻前后的孵化囊胚相比,Hba-α蛋白的表达量显著下调(P<0.05);冷冻后休眠胚胎Hba-α蛋白的表达量显著低于其他各组(P<0.05)。结论程序化冷冻处理对小鼠休眠胚胎Hba-α蛋白的表达影响明显大于孵化囊胚;Hba-α基因具有作为新型哺乳动物源抗冻蛋白的潜力。

程序化与玻璃化冷冻保存人D2和D3胚胎的临床结局比较

目的比较程序化和玻璃化冷冻保存人D2和D3胚胎的临床结局,分析探讨不同冷冻方法对人D2和D3胚胎冷冻的影响。方法回顾性分析了本中心170个D2和D3胚胎复苏周期,比较程序化和玻璃化冷冻复苏后的存活率、卵裂球存活指数、完胚率、≥1完胚移植率、种植率、临床妊娠率、流产率等指标。结果程序化解冻移植周期47个,存活率73.60%,卵裂球存活指数65.88%,完胚率31.46%,≥1完胚移植率80.85%,胚胎种植率14.17%,临床妊娠率36.17%,流产率11.76%。玻璃化解冻移植周期120个,存活率92.96%,卵裂球存活指数86.49%,完胚率68.04%,≥1完胚移植率90.83%,胚胎种植率18.84%,临床妊娠率35.83%,流产率9.30%。玻璃化冷冻比程序冷冻能显著提高胚胎存活率、卵裂球存活指数和完胚率(P<0.05),但在≥1完胚移植率、临床妊娠率、胚胎种植率和流产率上无显著性差异。无论采用哪种冷冻方法,D2和D3胚胎在所有统计指标上差异均没有显著意义。结论玻璃化冷冻是一种有效的冷冻方法,其复苏存活率、卵裂球存活指数和完胚率均明显高于程序化冷冻,可作为传统程序化冷冻的替代方法。D3胚胎冷冻没有比D2胚胎更有优势,对于工作量较大的IVF实验室可选择D2胚胎冷冻移植。

程序化冷冻前后小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎中C3基因表达的研究

试验旨在研究程序化冷冻前后小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎中C3蛋白的分布及转录水平的差异表达情况,为阐明哺乳动物胚胎在抗冻过程中的相关调控机制提供理论依据。试验选用ICR系雌性小鼠,从妊娠第5天小鼠子宫回收正常孵化囊胚;构建延迟着床模型获取小鼠休眠胚胎,利用激光共聚焦和实时荧光定量PCR技术对各组胚胎进行细胞免疫荧光和C3mRNA相对表达量的检测。结果发现,程序化冷冻前后的正常孵化囊胚和休眠胚胎中C3在转录和翻译水平均有表达;正常孵化囊胚经冷冻处理后C3mRNA相对表达量显著上调(P<0.05);休眠胚胎冷冻后C3mRNA相对表达量与冷冻前相比显著下调(P<0.05);冷冻前休眠胚胎C3mRNA相对表达量显著高于冷冻前正常孵化囊胚(P<0.05);冷冻后休眠胚胎C3mRNA相对表达量显著低于冷冻后正常孵化囊胚(P<0.05)。结果表明,胚胎中C3基因在转录水平的下调表达对胚胎抗冻具有一定的积极作用,C3基因很可能参与了胚胎抗冻过程的相关调控。

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2~4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至子宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响。结果表明:原核、2~4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2~4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2~4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2~4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2~4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率。

人卵巢组织慢速程序化冷冻保存方案的初步探讨

目的系统比较不同冷冻保护剂在不同浓度时对卵巢组织慢速程序化冷冻效果的影响。方法卵巢组织来源于15例卵巢良性肿瘤手术的患者。分别采用丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂,在每种冷冻保护剂1.5 mol/L或2.0 mol/L浓度下进行慢速程序化冷冻。每例患者平行进行上述6种冷冻程序,光镜及电镜下分析卵泡的形态正常率,结果与该患者的新鲜对照组织比较。结果各组中不同发育阶段的卵泡分布无统计学差异(P>0.05)。光镜观察显示,1.5mol/L EG组及2.0 mol/L EG组的冷冻效果最好,与新鲜对照组织相比卵泡形态正常率无统计学差异(P>0.05);1.5 mol/L PROH组、2.0 mol/L PROH组、1.5 mol/L DMSO组及2.0 mol/L DMSO组与新鲜对照组织相比,卵泡形态正常率的差异有统计学意义(P<0.05)。电镜观察显示,经程序化冷冻后,卵母细胞质量下降,但由于数据少未进行统计分析;与新鲜对照组织相比,6个冷冻组颗粒细胞的活力均明显降低(P<0.01)。形态正常的颗粒细胞数量在2.0 mol/L PROH组及1.5 mol/L EG组中稍高,但6个冷冻组间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢速程序化冷冻采用1.5 mol/L EG作为冷冻保护剂,能较好的保存卵泡中的卵母细胞及颗粒细胞,是一种较好的冷冻卵巢组织的方案。