程序性死亡受体-1与淋巴细胞活化基因-3在滤泡性淋巴瘤中的表达及临床意义

目的探讨程序性死亡受体-1(PD-1)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)在滤泡性淋巴瘤(FL)肿瘤微环境中的表达情况及临床意义。方法选取2017—2022年中国科学技术大学附属第一医院22例病理明确诊断为FL的患者,采用免疫组化方法检测FL患者标本中PD-1、LAG-3、细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)、细胞表面趋化因子受体4(CCR4)、细胞表面趋化因子受体3B(CXCR3B)、叉头蛋白P3抗体(FOXP3)因子的表达水平,分析PD-1、LAG-3与FL患者临床病理特征及预后的关系,并分析各因子间的相关性。结果PD-1高表达组和LAG-3高表达组β2微球蛋白(β_(2)-MG)水平高于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);PD-1/LAG-3双高表达组乳酸脱氢酶(LDH)和β2-MG水平高于PD-1/LAG-3单高表达组与PD-1/LAG-3双低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示在FL组织中,PD-1表达水平与LAG-3、CCR4、CXCR3B表达水平呈正相关(r=0.432、0.440、0.506,P<0.05),而与PD-L1和FOXP3表达水平无相关性(P>0.05)。PD-1高表达组、LAG-3高表达组和PD-1/LAG-3共同高表达组CD8^(+)T细胞计数少于对应低表达组,差异有统计学意义(P<0.05),进一步相关性分析结果显示PD-1表达、LAG-3表达以及PD-1/LAG-3共同表达与CD8^(+)T细胞计数呈负相关(r=-0.631、-0.425、-0.552,P<0.05)。生存分析结果显示LDH低表达组的无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)优于高表达组;PD-1低表达组、LAG-3低表达组和PD-1/LAG-3双低表达组的PFS和OS优于高表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PD-1、LAG-3高表达与FL患者较高的临床检验指标水平及较差的生存预后相关;PD-1、LAG-3等免疫检查点在肿瘤微环境中共同表达,影响T细胞计数。

PIM1基因对急性髓系白血病U937细胞增殖、凋亡及JAK2/STAT3信号通路的影响

目的:探讨PIM1基因对急性髓系白血病(AML)U937细胞增殖、凋亡的影响,以及对JAK2/STAT3通路的调控作用。方法:收集初诊成人AML患者和单纯缺铁性贫血患者的骨髓单个核细胞,荧光定量PCR检测PIM1 mRNA表达。将AML细胞系U937细胞分为:U937组(U937细胞正常培养)、Si-PIM1组(U937细胞转染含PIM1 mRNA的低表达腺病毒载体)、Si-NC组(U937细胞转染不含PIM1 mRNA的低表达腺病毒载体)、CoA1组(U937细胞中加入浓度为20μmol/L的JAK2激活剂CoA1)、Si-PIM1+CoA1组(U937细胞转染含PIM1 mRNA低表达的腺病毒载体并加入浓度为20μmol/L的CoA1)。培养24 h。荧光定量PCR和蛋白印迹法检测U937细胞PIM1 mRNA和蛋白、JAK2/STAT3通路、细胞周期、凋亡相关蛋白表达;噻唑蓝法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡率。结果:AML患者骨髓单个核细胞中PIM1 mRNA表达水平高于单纯缺铁性贫血患者(P<0.05)。与U937组相比,Si-PIM1组细胞PIM1 mRNA和蛋白、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、CDK2蛋白、细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例降低(均P<0.05),p27、Caspase-3蛋白、G0/G1期、凋亡率升高(均P<0.05),而CoA1组上述指标的变化情况与Si-PIM1组正好相反,CoA1可逆转Si-PIM1对U937细胞的作用效果。U937组、Si-PIM1+CoA1组、Si-NC组U937细胞上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:敲低PIM1基因表达可抑制U937细胞增殖、促进凋亡,缓解ALM进程,且上述作用可能与抑制JAK2/STAT3通路活化有关。

沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨叉头框转录因子O1(FOXO1)基因对腹主动脉瘤(AAA)血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法:收集19例AAA患者动脉瘤组织(AAA组)及邻近正常主动脉组织(对照组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平,透射电镜观察2组研究对象动脉瘤组织中自噬溶酶体形成情况;Western blotting法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1及自噬相关蛋白卷曲螺旋肌球蛋白样B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)结合蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3α(LC3)和P62蛋白表达水平。体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(hVSMCs),并采用FOXO1 siRNA(si-FOXO1)及其阴性对照(si-NC)慢病毒感染hVSMCs,10μmol·L^(-1)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合自噬激活剂雷帕霉素(Rap)进行干预,将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+si-FOXO1组、AngⅡ+si-NC+Rap组和AngⅡ+si-FOXO1+Rap组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,ELISA法检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平,RT-qPCR法检测各组细胞中FOXO1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、Beclin1、LC3和P62蛋白表达水平。结果:与对照组比较,AAA组动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平升高(P<0.05),自噬溶酶体数量增多(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),P62蛋白表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,AngⅡ组hVSMCs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平降低(P<0.05);与AngⅡ+si-NC组比较,AngⅡ+si-FOXO1组hVSMCs增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平降低(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved-caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。与AngⅡ+si-FOXO1组比较,AngⅡ+si-FOXO1+Rap组细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:FOXO1基因沉默可能通过降低自噬水平来提高AngⅡ暴露下hVSMCs增殖活性,并抑制其凋亡,从而参与AAA的发病。

SOCS1基因过表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

【目的】明确细胞因子信号转导抑制因子1基因(SOCS1)过表达对乳腺发育关键信号通路(JAK/STAT)相关基因表达的影响,为揭示SOCS1基因调节猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用机制提供参考依据。【方法】构建SOCS1基因过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC,分别转染猪乳腺上皮细胞,然后通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测转染后JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化。【结果】以过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC分别转染猪乳腺上皮细胞,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的SOCS1基因相对表达量极显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组(P<0.01,下同);转染48和72 h后,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组猪乳腺上皮细胞的OD值极显著低于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组,说明过表达载体pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制猪乳腺上皮细胞的增殖能力;过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的细胞凋亡率[(36.15±0.92)%]显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组[(30.55±0.35)%](P<0.05,下同),且过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组中的G1期细胞比例极显著降低,而S期和G2期细胞比例显著升高。与阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组相比,除JAK2、STAT3和TYK2基因外,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组中的SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCL1和PIAS3等9个JAK/STAT信号通路相关基因的相对表达量均极显著升高。【结论】SOCS1基因过表达可抑制猪乳腺上皮细胞增殖及促进细胞凋亡,并影响JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化,从而在猪的乳腺发生发育调控机制中发挥重要作用。

OMA1基因对人肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用及机制研究

目的研究人肺腺癌细胞A549和Calu-3中OMA1基因表达水平及其对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用,并探讨其作用机制。方法检测不同人肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞中OMA1基因和蛋白表达水平。分别在Calu-3(OMA1表达水平最高)和A549(OMA1表达水平最低)细胞进行OMA1沉默和过表达,测定各组细胞OMA1基因和蛋白表达、细胞增殖情况、迁移能力、侵袭能力和细胞凋亡率,及其对各组细胞中PI3K/AKT信号通路的影响。结果不同人肺腺癌细胞中OMA1基因和蛋白表达水平较正常肺上皮细胞均显著降低,其中在Calu-3细胞表达水平最高,在A549细胞中表达水平最低。Calu-3细胞转染shOMA1后OMA1基因和蛋白表达水平显著降低,增殖能力、迁移能力和侵袭能力显著升高,细胞凋亡率、PI3K/AKT信号通路相关基因和蛋白表达显著降低。A549细胞转染oeOMA1后OMA1基因和蛋白表达水平显著升高,增殖能力、迁移能力和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率、PI3K/AKT信号通路相关基因和蛋白表达显著升高。结论OMA1在肺腺癌细胞中低表达,OMA1可能通过调节PI3K/AKT信号通路相关基因和蛋白的表达发挥对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的抑制作用。

Beclin 1基因突变对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响

目的观察Beclin 1野生型、突变型质粒对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响。方法采用原代分离培养的大鼠颅骨成骨细胞,构建Beclin 1突变型质粒转染成骨细胞(MUT)和野生型质粒转染成骨细胞(WT),使用自噬激活剂rapamycin(Rapa)、自噬抑制剂Baf-A1(Baf)和Beclin1/Bcl2结合抑制剂mifepristone(Mif)干预细胞,分为NC组、Beclin1 WT组、Beclin1 WT+Baf-A1组、Beclin1 WT+mif组、Beclin1 Mut组、Beclin1 Mut+Rapa组。使用免疫共沉淀检测Beclin1-Bcl2复合物结合水平,通过MDC染色、溶酶体染色、流式检测、线粒体膜电位检测、Hoechest染色、免疫荧光、WB分别检测成骨细胞的自噬和凋亡表达情况。结果免疫共沉淀检测:与NC组相比,MUT组中Beclin1-Bcl2复合物水平显著降低(P<0.05);MDC染色显示:相对于NC组,WT细胞中溶酶体染色明显增加;细胞凋亡方面:与NC组相比,WT组、WT+Mif组细胞凋亡率显著上升,MUT细胞凋亡率低于WT细胞,比较差异具有统计学意义;JC-1检测显示:与NC组相比,WT细胞的线粒体跨膜电位异常改变,而MUT细胞样本的跨膜电位表达活跃。结论①Beclin 1的过表达可以抑制Beclin 1-Bcl2复合物的生成;②Beclin 1是参与自噬的重要基因,适度的Bcilin 1表达有利于维持细胞群的代谢平衡,Beclin 1的过表达对细胞自噬无明显影响;③Beclin 1过表达能抑制成骨细胞凋亡。

MiR-155靶向talin-1基因调控柱状黄杆菌胞外多糖诱导的EPC细胞凋亡

为研究miR-155在柱状黄杆菌胞外多糖(FC-EPS)诱导的细胞凋亡中的作用机制,本实验采用RNA干扰(RNAi)技术,通过过表达miR-155和敲降踝蛋白基因(talin-1),皆能抑制FC-EPS诱导的细胞凋亡,并鉴定出talin-1为miR-155的靶蛋白。在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中,踝蛋白水平显著升高,在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白Caspase-3的活化,同时检测到2条踝蛋白剪切异构体,大小分别约为200 ku和250 ku;将构建的鲤Talin-1真核表达质粒转染鲤上皮瘤细胞(EPC),过表达的Talin-1延迟且延长了细胞凋亡的进程,并检测到上述2条踝蛋白异构体。然而,当以FC-EPS转染EPC细胞时,Talin-1先下降再恢复到正常水平,细胞不发生凋亡。因此,在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中,细胞通过上调miR-155来调控靶基因talin-1 mRNA和蛋白转录的变化,以及产生Talin-1蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本研究为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。

青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡

背景:椎间盘退变是导致脊柱退行性疾病的基础,然而目前尚无有效的治疗药物。目的:探讨青藤碱是否可以抑制白细胞介素1β诱导的髓核细胞凋亡及其分子机制。方法:采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法体外培养大鼠髓核细胞,并绘制细胞生长曲线,采用CCK-8法筛选合适的青藤碱药物浓度。将髓核细胞分为对照组、青藤碱组、白细胞介素1β组、青藤碱+白细胞介素1β组、锌原卟啉(血红素氧合酶1抑制剂)组、锌原卟啉+青藤碱组、锌原卟啉+白细胞介素1β组、青藤碱+锌原卟啉+白细胞介素1β组。分别检测各组髓核细胞增殖活性、活性氧含量、凋亡率及血红素氧合酶1的表达情况。结果与结论:①体外培养的大鼠髓核细胞呈现多角形、三角形、短楔形等形态,其呈现“S”型曲线生长,接种第1-3天生长缓慢,第4-6天生长迅速,第七八天生长速度缓慢,进入“平台期”,细胞数量不再增加;②当青藤碱的浓度≤80μmol/L时,髓核细胞的增殖活性不会受到显著影响(P>0.05);③白细胞介素1β可以显著降低髓核细胞的增殖活性,增加活性氧含量,导致细胞凋亡(P<0.01);④当采用青藤碱干预后,不仅可以促进血红素氧合酶1的表达(P<0.05),而且可以抑制白细胞介素1β诱导的髓核细胞增殖活性降低、活性氧含量和凋亡率增加(P<0.05),其作用可被锌原卟啉逆转(P<0.01)。

邻苯二甲酸二-2-乙基己酯通过ROS/PTEN/PI3K/AKT轴诱导HD11细胞凋亡和程序性坏死

旨在探究邻苯二甲酸二-2-乙基己酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)]暴露通过ROS/PTEN/PI3K/AKT通路诱导细胞凋亡和程序性坏死的作用机制。本试验以HD11细胞为研究对象,设置对照组(C组)、30μmol·L^(-1)DEHP组(L组)、60μmol·L^(-1)DEHP组(M组)和90μmol·L^(-1)DEHP组(H组)。用不同浓度的DEHP处理HD11细胞24 h后,采用CCK-8检测细胞存活情况,生化试剂盒检测氧化应激指标,包括活性氧(ROS)水平,丙二醛(MDA)含量与总抗氧化能力(T-AOC)水平,以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。采用AO/EB染色和流式细胞术检测凋亡率和坏死率,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测PTEN/PI3K/AKT通路基因及凋亡与坏死相关基因的mRNA和蛋白表达,结果表明,与对照组相比,DEHP暴露可显著抑制HD11细胞的活力,且半数抑制浓度(IC_(50))为180.644μmol·L^(-1)。与对照组相比,L、M、H DEHP组AO/EB染色和流式细胞术结果显示DEHP暴露导致HD11细胞具有典型的凋亡和坏死特征。与对照组相比,L、M、H DEHP组ROS水平呈现上升趋势(P<0.01),L、M、H DEHP组MDA含量显著升高(P<0.01),而T-AOC水平显著降低(P<0.01),T-SOD和GSH-PX活性显著降低(P<0.01),提示DEHP暴露诱导HD11细胞发生氧化应激损伤。此外,与对照组相比,DEHP暴露上调了PTEN/Bax/Caspase-3/Caspase-9/RIPK1/RIPK3/MLKL的mRNA和蛋白表达(P<0.01),而PI3K/AKT/BCL-2的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),提示DEHP暴露通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导HD11细胞凋亡和程序性坏死。综上所述,DEHP可以通过调控ROS/PTEN/PI3K/AKT轴诱导HD11细胞凋亡和程序性坏死,并存在明显的剂量-效应关系。

程序性细胞凋亡1基因单倍型及紫外线暴露与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的 探讨中国长江以南汉族人群中程序性细胞凋亡1基因（programmed celll death 1,PDCD1）多态性与紫外线暴露在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）发病中的关系.方法 采用病例对照研究设计,收集159例病例和159名对照,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术检测PDCD1基因多态;分别在隐性、显性、相加及共显性遗传模式下,应用Logistic回归模型估计基因、环境及基因-环境交互效应.结果 根据赤池信息量准则（Akaike＇s Information Criteria,AIC）值最小原则,筛出3个相加遗传模式下的最优模型和1个显性遗传模式下的最优模型.控制年龄与性别因素后,4个模型均存在SLE患病人群既往紫外线暴露率高于对照组,差异有统计学意义（P值均＜0.05）.在由PDCD1基因PD1.2、PD1.5及PD1.6多态位点等位基因组成的单倍型方面,在相加遗传模式下,SLE患者人群的G-T-A单倍型频率高于对照组（0.1196 vs 0.0363）,差异有统计学意义（P＜0.05,OR=4.319）;而A-C-A单倍型频率病例组低于对照组（0.4746 vs 0.5399）,差异亦有统计学意义（P＜0.05,OR=0.571）;此遗传模式下,还发现A-C-G单倍型与紫外线暴露存在交互作用,（β5=1.182,Z=2.2898,P＜0.05,OR=3.261）.此外,在显性遗传模式下,SLE患者人群的G-C-G单倍型频率高于对照组（0.1287 vs 0.0361）,差异有统计学意义（P＜0.05,OR=4.332）.结论 特定遗传模式下,紫外线暴露、PDCD1基因G-C-G或G-T-A单倍型以及A-C-G单倍型与紫外线暴露的交互作用可能与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮的遗传易感性相关.

胡黄连苷Ⅱ调节RIP1/RIP3/MLKL信号对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响

目的探讨胡黄连苷Ⅱ调节受体相互作用蛋白激酶(RIP)1/RIP3/混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)信号对地塞米松(DEX)诱导成骨细胞凋亡的影响。方法体外培养hFOB 1.19细胞,随机分为对照组、DEX组、DEX+胡黄连苷Ⅱ组、DEX+RIP1过表达组、DEX+空载质粒组、DEX+胡黄连苷Ⅱ+RIP1过表达组,分组处理后检测各组细胞活力、凋亡率、活性氧(ROS)相对水平、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-6释放量、BCL-2及BAX相对表达、RIP1/RIP3/MLKL信号蛋白表达。结果与对照组相比,DEX组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05)。与DEX组相比,DEX+胡黄连苷Ⅱ组细胞活力、BCL-2相对表达升高(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达降低(P<0.05);DEX+RIP1过表达组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05);DEX+空载质粒组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05);过表达RIP1可减弱胡黄连苷Ⅱ对DEX诱导的hFOB 1.19细胞的作用。结论胡黄连苷Ⅱ可通过下调RIP1/RIP3/MLKL通路而减轻炎症,从而抑制DEX诱导的成骨细胞凋亡。

姜酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法:培养HT22细胞,设置不同OGD/R时间梯度,建立OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+1μmol·L^(-1)姜酮组、OGD/R+10μmol·L^(-1)姜酮、OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组和OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理4 h后予以OGD 8 h和复糖复氧8 h处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10μmol·L^(-1)ML385预处理6 h,CCK-8法检测各组细胞活性,Western blotting法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,HT22细胞经OGD 8 h和复糖复糖8 h处理后细胞存活率低于50%,以OGD 8 h和复糖复糖8 h建立HT22细胞OGD/R模型。与OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组细胞存活率升高最明显(P<0.01),故选用100μmol·L^(-1)姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.05)。结论:姜酮可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用。

基于miR-153/TREM1探讨健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的作用机制

目的探究健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的作用机制。方法通过miRNA微阵列芯片和RT-PCR分析出脑出血中miR-153的表达,观察并分析miR-153与脑出血神经细胞凋亡关系;预测miR-153的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验观察其与靶基因的结合情况,观察过表达和抑制miR-153对靶基因的影响,随后,明确靶基因与脑出血神经细胞凋亡关系,最后观察健神利水方对miR-153、靶基因的影响,最终探究健神利水方对脑出血大鼠神经细胞凋亡的相关机制。结果微阵列芯片和RT-PCR检测表明miR-153在脑出血中是低表达的(P<0.05),miR-153与神经细胞凋亡呈负相关(R:-0.875,P=0.0002)。在线数据库TargetScan和miRDB显示miR-153与TREM1具有结合区域,双荧光素酶报告基因实验证明两者具有结合关系,当miR-153过表达时,TREM1表达量会下调,相反,当miR-153抑制时,TREM1表达量会上调,TREM1与神经细胞凋亡呈正相关(R:0.857,P<0.001)。健神利水方组的TREM1表达量、神经细胞凋亡数量、神经功能缺损评分均低于模型组(P<0.05),miR-153表达量高于模型组(P<0.05)。健神利水方+miR-153抑制组的TREM1表达量、神经细胞凋亡数量、神经功能缺损评分均高于健神利水方组(P<0.05)。结论健神利水方通过促进miR-153表达,抑制TREM1表达来达到抑制脑出血大鼠神经细胞凋亡,保护神经功能。

牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

瑞香素调控DJ-1表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的影响

目的探讨中药活性成分瑞香素调控DJ-1表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的影响。方法以子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,CCK-8法分析瑞香素对Ishikawa细胞增殖的影响,qRT-PCR检测瑞香素对Ishikawa细胞DJ-1 mRNA表达,流式细胞术检测瑞香素对Ishikawa细胞凋亡的影响。结果不同浓度瑞香素处理Ishikawa细胞后,细胞增殖抑制率较对照组明显增加,且呈现时间-浓度依赖性,瑞香素处理Ishikawa细胞48 h,抑制率IC50值为78μmol/L;与对照组相比,78μmol/L瑞香素处理Ishikawa细胞48 h,其DJ-1mRNA表达量明显降低(P<0.05),同时早期凋亡率(P<0.01)和晚期凋亡率(P<0.05)均明显升高。结论瑞香素可通过降调DJ-1的表达促进子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡,并呈剂量依赖关系。

Mdivi-1通过抑制少突胶质细胞凋亡信号通路发挥髓鞘保护作用

目的:研究线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠髓鞘保护中的作用,探讨Mdivi-1抑制髓鞘变性的机制。方法:小鼠经髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白第35~55位肽段(MOG35-55)免疫后,随机分为DMSO模型组和Mdivi-1干预组。于免疫后第28天处死小鼠,行Luxol fast blue染色分析髓鞘丢失情况,免疫荧光染色和TUNEL染色小鼠脊髓组织和体外细胞实验分析Mdivi-1髓鞘保护机制。结果:与DMSO模型组比较,Mdivi-1处理明显减少EAE小鼠脊髓组织白质区髓鞘丢失,减少少突胶质细胞凋亡及线粒体凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C和Bax的表达;体外MO3.13少突胶质细胞培养实验发现,Mdivi-1可以明显阻止星形孢菌素(staurosporine)处理诱导的线粒体膜电位去极化,减轻细胞损伤,增强细胞活力。结论:Mdivi-1可能通过抑制少突胶质细胞线粒体相关凋亡信号通路发挥髓鞘保护作用。

lncRNA NEAT1降表达人喉鳞状细胞癌细胞增殖凋亡变化及与miR-214靶向关系

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)核富集转录体1(NEAT1)降表达的人喉鳞状细胞癌(LSCC)细胞增殖凋亡变化,探讨其与微小RNA-214(miR-214)的靶向关系。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测人永生化表皮细胞Hacat和人LSCC细胞系(FD-LSC-1、Hep-2、TU177)中lncRNA NEAT1、miR-214,选择TU177细胞为受试细胞。取对数生长期TU177细胞,分为甲、乙组,分别转染si-lncRNA NEAT1(敲低lncRNA NEAT1表达)、si-NC(乱序无意义序列),培养至24 h时采用CCK8法观察两组细胞增殖情况、采用平板克隆形成实验观察两组细胞克隆形成情况、采用流式细胞术观察两组细胞周期和细胞凋亡情况、采用RT-qPCR法检测两组细胞lncRNA NEAT1及miR-214。另取对数生长期TU177细胞,分为一二三四组,一组顺序转染WT-lncRNA NEAT1、miR-214 mimic,二组顺序转染WT-lncRNA NEAT1、miR-NC,三组顺序转染MUT-lncRNA NEAT1、miR-214 mimics,四组顺序转染MUT-lncRNA NEAT1、miR-NC。采用双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA NEAT1及miR-214的靶向关系。结果与乙组相比,培养24、48、72 h时甲组TU177细胞OD值低,培养14 d时甲组TU177细胞克隆形成数少,甲组TU177细胞G0/G1期细胞比例高、S期细胞比例低,细胞凋亡率高(P均<0.05);与乙组相比,转染24 h时甲组TU177细胞lncRNA NEAT1相对表达量低、miR-214相对表达量高(P均<0.05)。培养48 h时一、二、三、四组TU177细胞细胞荧光素酶活性分别为0.63±0.08、0.99±0.01、1.02±0.02、0.98±0.03,与二组相比,一组细胞荧光素酶活性低(P<0.05)。结论敲低lncRNA NEAT1表达可抑制TU177细胞的增殖和克隆,阻滞细胞周期于G0/G1期,并促进细胞的凋亡。TU177细胞中lncRNA NEAT1与miR-214靶向相关。lncRNA NEAT1可能通过与miR-214靶向结合,抑制TU177细胞的增殖克隆,阻滞细胞周期于G0/G1期,促进细胞的凋亡。

miR-21低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响及与PTEN靶向关系

目的观察微小RNA-21(miR-21)低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响,并分析其与第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)的靶向关系。方法取对数生长期的RC-4BC细胞分为两组,沉默组转染miR-21抑制物miR-21 inhibitor,阴性对照组转染抑制物阴性对照NC-inhibitor,采用RT-PCR法检测miR-21、第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)mRNA,采用CCK8实验观察两组细胞增殖能力(以OD值表示),采用平板克隆实验观察两组细胞集落形成能力(以集落形成数表示),采用流式细胞术观察两组细胞凋亡率并观察细胞周期分布情况。收集RC-4BC细胞制备单细胞悬液,分别将miR-21 mimics或NC-mimics与PTEN-WT或PTEN-MUT共转染至RC-4BC细胞,转染后细胞标记为miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PTEN的靶向关系。结果沉默组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为0.30±0.08、2.89±0.14,阴性对照组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为1.01±0.02、0.99±0.03,两组相比,P均<0.05。沉默组RC-4BC细胞24 h、48 h、72 h时OD值均低于阴性对照组(P均<0.05)。沉默组RC-4BC细胞集落形成数低于阴性对照组(P<0.05)。沉默组RC-4BC细胞凋亡率高于阴性对照组(P<0.05)。沉默组RC-4BC细胞G0/G1期占比65.65%±7.82%、S期占比19.25%±3.70%,阴性对照组RC-4BC细胞G0/G1期占比45.62%±5.03%、S期占比35.72%±4.67%,两组相比,P均<0.05。miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组细胞的相对荧光素酶活性分别为0.39±0.07、1.02±0.03、1.01±0.04、1.00±0.03,其中miR-21 mimics+PTEN-WT组相对荧光素酶活性与其他各组相比,P均<0.05。结论沉默miR-21能够移至垂体瘤细胞系RC-4BC的增殖、促进其凋亡,其机制可能与靶向调控PTEN基因有关。

青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

隐丹参酮调节HIF-1α/BNIP3信号通路对兔膝骨关节炎模型软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的 探究隐丹参酮调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路对兔膝骨关节炎(KOA)模型软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法 取新西兰兔并以改良Videman法构建兔KOA模型,随机分为模型组、空载组、隐丹参酮组、HIF-1α敲低组、隐丹参酮+HIF-1α敲低组,每组9只;另取9只新西兰兔为对照组。分组干预后以Lequesne MG的膝关节级别评估法对兔膝关节临床症状(局部疼痛、步态、关节活动、关节肿胀)进行评分;HE染色检测兔膝关节软骨组织的退变情况并进行改良Mankin's评分;TUNEL染色检测兔膝关节软骨组织细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测兔血清炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-18、IL-10水平;蛋白免疫印迹实验检测兔膝关节软骨组织自噬(LC3、Beclin-1)、凋亡(Bax、Cleaved Caspase-3)和HIF-1α/BNIP3信号通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组兔膝关节软骨组织出现明显退变症状,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,隐丹参酮组兔膝关节软骨组织退变症状减轻,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平降低,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05);HIF-1α敲低组兔膝关节软骨组织退变症状加重,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05);空载组兔各指标无明显变化(P>0.05)。隐丹参酮+HIF-1α敲低组较隐丹参酮组兔膝关节软骨组织退变症状加重,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05);较HIF-1α敲低组上述指标变化相反。结论 隐丹参酮可通过上调HIF-1α、下调BNIP3表达,抑制炎症及自噬,减轻KOA兔膝关节软骨组织退变,改善其临床症状。