稳定同位素探针技术在环境微生态领域的应用

介绍了稳定同位素探针技术的概况,并对稳定同位素探针技术在环境微生态领域中的应用和其局限性进行了概述,为探索微生物种群结构和功能等微生态学研究提供了强有力手段。

厌氧消化污泥体系的DNA-稳定同位素探针标记条件研究

DNA稳定同位素探针(DNA stable-isotope probing,DNA-SIP)是鉴别复杂环境中功能微生物的有力工具。获得足够的标记^(13)C-DNA是该技术的关键,但^(13)C-DNA的富集受很多因素的影响。本研究以^(13)C-葡萄糖为底物,考察了不同条件(离心转速,底物投加量和污泥固含量)对厌氧消化污泥体系的DNA-SIP标记效果。结果显示:相对低的转速、高底物投加量及低污泥固含量有助于^(13)C-DNA的富集。对本研究的厌氧污泥,45400 rpm超高速离心40h(20℃),100 mg^(13)C-葡萄糖投加量,0.4%(w/w)污泥固含量可以获得较高的^(13)C-DNA丰度。该结果有助于指导厌氧消化体系中功能菌群的鉴定,进而促进对厌氧产甲烷机制的理解。

稳定同位素探针技术结合宏基因组学在探究环境污染物微生物转化/降解过程中的应用进展

稳定同位素探针技术(SIP)结合宏基因组学在环境污染物微生物转化/降解研究中的应用已逐渐成为趋势.该组合技术不依赖纯培养方法,能够从复杂自然环境中鉴定出具有特定代谢功能的微生物类群,揭示污染物的微生物代谢途径,在研究污染物的原位微生物转化/降解过程方面具有显著优势.本文综述了该组合技术在探究不同环境介质中烃类化合物及其衍生物、有机农药、重金属和新型污染物微生物转化/降解过程中的应用进展,包括功能微生物的识别和污染物微生物转化/降解机制的解析等.最后,基于该组合技术的应用现状进行了展望,提出未来该组合技术与多种原位表征技术的联用将为微生物驱动污染物的转化/降解机制研究提供更准确全面的信息.

基于稳定性同位素核酸探针技术的同化利用玉米秸秆碳微生物群落演替研究

[目的]研究秸秆分解过程中同化利用秸秆碳源的微生物生态演替过程,明确参与秸秆分解的主要微生物类群,为秸秆高效利用提供科学依据。[方法]采用^(13)C标记高丰度玉米秸秆。微宇宙室内培养试验的供试土壤为华北平原石灰性潮土。共设置3个处理:不添加秸秆(soil)、添加自然丰度秸秆(soil+^(12)C-straw)和添加13C标记秸秆(soil+^(13)C-straw)。培养30天时,结合同位素示踪与高通量测序等技术,测定秸秆添加对土壤有机碳的激发效应,分析利用秸秆碳源的细菌、真菌群落结构及其与土壤胞外酶活性的关系。[结果](1)秸秆添加显著提高了土壤CO^(2)排放,添加秸秆对土壤有机碳的激发效应在培养第1天达到峰值,土壤和秸秆CO^(2)排放比例均在培养第3天达到峰值。(2)整个培养时期共发现参与秸秆碳同化利用的细菌微生物操作分类单元(operational taxonomic units,OTU_(s))238个,真菌OTU_(s)24个。细菌OTU_(s)主要属于细菌变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)与绿弯菌门(Chloroflexi),真菌OTU_(s)主要为子囊菌门中的粪壳菌纲(Sordariomycetes)。(3)秸秆分解不同时期的微生物群落结构存在显著差异,在整个培养时期,以热单胞菌属(Thermomonas)与溶杆菌属(Lysobacter)为代表的7个细菌属快速响应秸秆添加,以假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)与土生单胞菌属(Terrimonas)为代表的6个细菌属延迟响应;两个真菌属枝鼻菌属(Cladorrhinum)与葡萄穗霉属(Stachybotrys)表现为对秸秆添加的快速响应,新赤壳属(Neocosmospora)与unclassified_f_Halosphaeriaceae为延迟响应。(4)曼特尔分析表明,细菌热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌裂壳菌属(Schizothecium)与碳氮转化相关土壤胞外酶活性呈显著正相关关系。[结论]外源秸秆添加对土壤有机碳产生正激发效应,显著增加了土壤CO^(2)排放。同化秸秆碳源的微生物随培养时间延长发生群落演替,细菌的热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌的裂壳菌属(Schizothecium)在玉米秸秆分解过程中具有重要作用,可为秸秆高效腐熟菌剂的研发提供依据。

稳定同位素探针技术在有机污染物生物降解中的应用

稳定同位素探针技术(Stable isotope probing,SIP)是稳定同位素标记技术和各种分子生物学手段相结合的一系列技术总称。将其应用于探查污染物降解的功能微生物,实现了不经过分离培养直接把微生物的代谢功能、微生物间相互作用与微生物种群结合起来,从而克服了传统分离培养的缺陷,扩大了微生物资源的利用空间,具有广阔的发展前景。本文介绍了稳定同位素探针技术的基本原理和技术路线,对常规PLFA-SIP、DNA-SIP、RNA-SIP的特点进行了阐述和对比;综述了SIP在有机污染物——苯系物、多环芳烃、多氯联苯生物降解方面的研究进展,提出SIP应用于根际研究是今后该技术在生物降解研究中的一个发展方向。

稳定性同位素探针技术在土壤功能微生物原位鉴定的应用

新近发展起来的稳定性同位素探针技术(SIP)与分子生物学方法结合,能够定向发掘复杂环境中参与特定生态过程的微生物资源,是土壤功能微生物原位鉴定的有效手段,具有广阔的应用前景。其原理是环境样品中的功能微生物代谢同化同位素标记的底物,通过对其生物标志物(即DNA、RNA、PLFA等)进行提取、分离、鉴定和比对分析,以此获取介导土壤物质转化和循环过程的功能微生物的直接信息。本文在分别介绍SIP技术在土壤功能微生物原位鉴定过程中的各种前处理方法、生物标志物选择及后续鉴定方法的基础上,综述了SIP技术在研究驱动土壤有机污染物生物降解、碳氮循环等过程的功能微生物原位鉴定的应用进展,展望了SIP技术在土壤微生物基因组学方面的应用前景。

基于稳定性同位素核酸探针技术的红壤微生物底物利用策略研究

外源活性碳底物输入强烈影响土壤微生物的生长,但是在系统发育分类水平上,细菌和真菌对活性底物的动态响应及利用特征和微生物群落组成的关系仍不清楚。以红壤为研究对象,采用;C标记葡萄糖为底物进行模拟培养并定期取样,利用稳定性同位素核酸探针(DNA-based stable isotope probing,DNA-SIP)和高通量测序技术分析活性的真菌和细菌类群,并探讨不同微生物利用葡萄糖来源碳的动态特征。研究发现,微生物群落对葡萄糖的利用符合从细菌向真菌演替的r/K选择策略。在细菌群落中,隶属于富营养菌的变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)对活性底物的利用能力显著高于寡营养菌的酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)。和细菌的底物利用策略不同,真菌子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)在整个培养期间均可以利用葡萄糖和土壤原有组分。因此,葡萄糖的连续加入并未改变不同营养类型细菌的底物利用策略,而真菌对底物的利用具有广谱性特征,活性底物可诱导真菌对土壤原有组分的利用。

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP(Stable isotope probing),是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。微生物的体积在μm尺度,因此,自然环境中微生物群落在μm尺度下生理过程的发生、发展,其新陈代谢物质在环境中累积与消减的动力学变化规律,形成了微生物生理生态过程,决定了不同尺度下生态系统物质和能量的良性循环。利用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA,实现了单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变,能在更高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源,推动微生物生理生态学和生物技术开发应用。本文重点探讨了DNA-SIP的技术原理、主要技术瓶颈及对策,初步展望了DNA-SIP为基础的环境微生物基因组学发展趋势。

水稻土好氧甲烷氧化菌对大气CO_(2)浓度升高的适应规律

CH4是仅次于CO_(2)的第二大温室气体,而稻田是CH4的主要排放源,未来大气CO_(2)浓度升高情景下(elevatedCO_(2),eCO_(2)),水稻土好氧甲烷氧化过程及其功能微生物群落适应规律尚不清楚。依托中国FACE(FreeAir CO_(2) Enrichment)水稻田试验平台,通过13C-CH4示踪的室内微宇宙培养实验,采用稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)和高通量测序技术,研究未来大气CO_(2)浓度升高对水稻土甲烷氧化活性及其功能微生物的影响规律。结果表明:与常规大气CO_(2)浓度(ambient CO_(2),aCO_(2))相比,eCO_(2)条件下的甲烷氧化活性显著增加,从243 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1)增加至302 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1),增幅高达24.3%,甲烷氧化菌数量则增加了1.1倍~1.2倍。通过超高速离心获得活性甲烷氧化菌同化13CH4后合成的13C-DNA,高通量测序发现,未来大气CO_(2)升高情景下水稻土活性好氧甲烷氧化微生物群落极可能发生明显演替,与对照相比,类型I甲烷氧化菌甲基杆菌属Methylobacter的相对丰度增加16.2%~17.0%,而甲基八叠球菌属Methylosarcina的相对丰度下降4.7%~11.1%;同时刺激了食酸菌属Acidovorax和假单胞菌属Pseudomonas等非甲烷氧化菌的活性。综上所述:未来大气CO_(2)升高情景下,水稻土好氧甲烷氧化微生物群落结构发生分异,促进了甲烷氧化通量,而甲烷氧化的代谢产物可能引发土壤中微生物食物网的级联反应,是土壤碳储存和周转的重要功能微生物群。

自养微生物同化CO_2的分子生态研究及同化碳在土壤中的转化

大气中CO2浓度持续升高和全球气候变暖是亟待解决的重大环境问题。自养微生物在环境中广泛分布,能直接参与CO2的同化,因此研究自养微生物同化CO2的分子生态学机制具有重大的科学意义。以往对自养微生物的研究多针对基因组DNA,从DNA水平揭示了不同生态系统中碳同化自养微生物的种群结构和多样性,但这些微生物在生态系统中的具体功能有待进一步的研究。近年来,随着转录组学研究技术和稳定同位素探针技术(SIP)的发展,自养微生物同化CO2的生态机理研究不断深入,这些研究明确揭示了碳同化自养微生物是河流、湖泊和海洋生态系统中CO2固定作用的驱动者,并新发现了一些具有CO2同化功能的微生物群落。基于国内外有关研究进展,从DNA和RNA水平上对自养微生物同化CO2的分子机理以及稳定同位素探针技术(SIP)在碳同化微生物研究中的应用进行了分析和总结,初步展望了RNA-SIP技术在陆地生态系统碳同化微生物分子生态学研究中的前景。同时,探讨了陆地生态系统同化碳的转化和稳定性机理,以期为深入了解生态系统碳循环过程和应对气候变化提供理论依据。

青枯病导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落差异分析

【目的】探明导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落演替规律,为研究连作障碍发生的微生物机制奠定基础。【方法】通过“限微模拟宇宙系统”,采用稳定同位素核酸探针(DNA-SIP)技术标记氮来源,利用宏基因组高通量测序技术开展导病抑病植烟根际土壤氮循环微生物特征分析,并建立特征微生物与烟叶品质、产质量、青枯病发病状况等表观数据的相关性。【结果】导病抑病土壤中参与氮素循环的微生物种类具有差异,导病与抑病土壤中受根系分泌物调控的特有微生物分别为受土壤本身影响微生物数量的63.9%和1.29倍;在根系分泌物介导下,导病土壤中与氮循环相关的物种群落主要为变形菌门(Proteobacteria),主要上调与细胞运动和转运有关的基因;抑病土壤中主要为放线菌门(Actinobacteria),主要上调与物质转运与代谢有关的基因。导病与抑病土氮循环微生物具有显著差异的物种为硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和木纹杆菌门(Lgnavibacteriae);抑病土壤中与质量指标间存在极显著相关关系的微生物属比导病土壤少21.7%,但抑病土壤微生物与烟叶品质关键指标茄酮间关联性是交叉互作的,显著相关比例较导病土提升19.3百分点。【结论】根系分泌物主要影响导病土壤与氮素循环相关的微生物,土壤本身的性状主要影响抑病土壤氮素循环相关微生物,即导病土壤微生物易受作物的影响发生病害;抑病土壤通过调控土壤微生物对烟叶质量的影响,保持烟叶质量的稳定状态。

元蛋白质组学在土壤微生物生态功能研究中的应用!

元蛋白质组学是近年出现的一种基于蛋白质组学对微生物群落进行研究的新技术,其定义为对特定环境的所有微生物蛋白质进行的即时的、大规模的分析。虽然目前对元蛋白质组学的研究还处在起步阶段,但是它已在特定环境的微生物研究中显现出其强大的功能。本文通过对目前元蛋白质组学常用研究策略和技术进行比较,概述土壤元蛋白质组的提取、纯化、分离与功能鉴定等方面的研究现状,并对土壤元蛋白质组学研究的意义进行了展望。土壤元蛋白质组学的发展深受提取方法的影响,现有的方法很难提供既可成功分离又易于鉴定的蛋白质,而土壤蛋白鉴定的主要问题在于土壤蛋白质含量低,通过质谱分析对蛋白质鉴定时缺乏足够的序列-数据库信息。一旦这些问题得以解决,土壤元蛋白质组学便能在土壤微生物生态功能研究方面得到更加广泛和深入的应用。

碳同位素示踪技术及其在陆地生态系统碳循环研究中的应用与展望

碳同位素示踪技术具有高度的专一性和灵敏度,经过几十年的发展,形成了一系列成熟的标记方法,在陆地生态系统碳循环过程的研究中已得到广泛应用。目前,自然丰度法、与13C贫化示踪技术结合的自由空气中气体浓度增加(FACE)实验、脉冲与连续标记法以及碳同位素高丰度底物富集标记法是研究陆地生态系统碳循环过程常用的碳同位素示踪方法;通过将长期定位实验和室内模拟实验结合,量化光合碳在植物-土壤系统的传输与分配特征,明确植物光合碳对土壤有机质的来源、稳定化过程的影响及其微生物驱动机制;阐明土壤碳动态变化(迁移与转化)和新碳与老碳对土壤碳库储量的相对贡献,评估有机碳输入、转化与稳定的生物与非生物微观界面过程机制。然而,生态系统碳循环受气候、植被、人为活动等多因素影响,碳同位素技术需要结合质谱、光谱技术实现原位示踪,结合分子生物学技术阐明其微生物驱动机制,从而构建灵敏、准确、多尺度、多方位的同位素示踪技术体系。因此,该文以稳定碳同位素为主,综述了碳同位素示踪技术的原理、分析方法和在陆地生态系统碳循环过程中的应用进展,归纳总结了碳同位素示踪技术结合原位检测技术和分子生物学技术的研究进展和应用前景,并对碳同位素示踪技术存在的问题进行了分析和展望。

油气微生物分子勘探技术与初步应用

油气微生物勘探技术因其多解性小、信噪比高、受环境影响小、经济快速的特点,越来越受到勘探家的重视。随着高通量测序、分子生物学技术及生物信息学的快速发展,从微生物群落整体的角度描述特定油气指示微生物的变化,已成为未来微生物勘探技术的重要发展方向。介绍土壤样品采集、DNA提取与分析、判别模型建立和有利区预测等4个油气微生物分子勘探技术关键环节,并针对土壤DNA提取和油气指示微生物检测进行重点阐述。工业级DNA提取技术研究发现,Griffth方法提取并纯化土壤微生物DNA效果最佳。针对大样本量工程,使用高通量移液工作站和商用多孔板DNA抽提试剂盒可大幅提高勘探效率;综合稳定性同位素探针和高通量测序的分子检测技术研究探明了典型含油气区主要油气指示微生物菌种分布规律,高频油指示菌(AMNR族)为节杆菌、分枝杆菌、诺卡氏菌和红螺菌,高频气指示菌为甲基球菌、甲基杆菌、甲基孢囊菌。微生物分子勘探技术在鄂尔多斯盆地杭锦旗地区的初步应用表明,该技术在黄土塬地貌区油气识别精度显著提升,在含油气性评价方面效果良好,为鄂尔多斯盆地北部致密气有利区带筛选提供了参考依据。

稻田生物固氮研究进展及方向

稻田淹水产生的合适pH和氧化-还原条件为固氮微生物的固氮提供了适宜环境条件,使得稻田在多年不施氮肥条件下仍能维持一定产量,而旱地产量则逐年下降。随着化学氮肥用量的增加,导致了严重的环境污染,迫切需要增加生物固氮来保证粮食生产和减少环境污染。为发挥稻田生物固氮功能,我们对稻田生物固氮的研究方法、固氮量、固氮微生物、影响因素、调控及其研究方向进行综述,以期为稻田生物固氮研究提供参考。

土壤阿特拉津的生物修复机制的研究

阿特拉津主要用于一年生禾本科杂草和阔叶杂草的防除,由于其成本低、除草效果好,已迅速在世界范围内广泛使用。阿特拉津不易降解,在环境中持留时间长,频繁使用会污染农田土壤及周围水体,对生态环境和人类健康产生威胁。环境中的微生物种类基数大,容易异变,适应能力强,生物降解因具有高效、成本低,无二次污染的优点而成为研究的焦点。文章运用稳定性同位素探针技术(SIP)与各种分子生物学手段结合,展望了同位素探针技术在鉴定降解有机污染物的功能菌方面的前景。

PAHs降解功能菌的识别与生物强化修复PAHs污染土壤研究进展

多环芳烃(PAHs)是有毒有机污染物,具有致突变、致畸和致癌性作用,广泛存在于被污染的土壤环境中,对人类健康构成了严重威胁。生物强化(BA)是一种经济有效的去除土壤中PAHs的环境修复技术,筛选和识别能够降解PAHs的功能菌是该技术研发与应用的首要任务。综述了富集培养法和稳定同位素探针(SIP)技术对PAHs降解功能微生物发掘的研究进展,分析了BA修复技术应用局限及对应策略,以期为BA技术进步与应用推广提供借鉴与参考。

植物光合碳在根际土壤中的微生物转化与SIP技术

光合碳是"大气-植物-土壤"系统碳循环的重要组成部分,也是土壤有机碳的重要来源。根际土壤微生物在植物光合碳转化过程中起到关键作用。由稳定性同位素标记技术与分子生物学技术相结合发展起来的稳定性同位素探测技术(stable isotope probing,SIP),可确定参与碳转化的微生物群落结构和功能,以及复杂群落中微生物相互关系,在研究有机碳和微生物相互作用关系方面具有广阔的应用前景。简要概述了光合碳在植物地下部的分配,总结了根系分泌物和微生物之间的关系,介绍了利用PLFA-SIP、RNA-SIP和DNA-SIP技术研究碳转化相关微生物的优势,提出了该技术目前存在的一些问题,展望了其在微生物生态研究上的应用。

DNA-SIP鉴定甘蔗//大豆间作土壤^(15)N-DNA富集位置的氮循环功能基因qPCR方法

为筛选有效鉴定甘蔗//大豆间作系统的稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP)中超高速离心后15N-DNA富集位置的指示功能基因,利用实时荧光定量PCR技术(qPCR),检测6个氮素循环功能基因在不同浮力密度离心液DNA中的相对丰度分布,通过对氮素循环功能基因相对丰度作图分析,nifH和amoA基因在甘蔗//大豆间作和大豆单作种植模式中15N标记组与对照组基因丰度峰发生偏移,chiA基因丰度峰仅在大豆单作种植模式下存在偏移,而nirS、nirK、nosZ等3个基因的丰度峰值在两种种植模式下均不发生偏移。结果表明nifH和amoA基因可作为指示基因,能够有效鉴定甘蔗//大豆间作系统中DNA-SIP技术15N-DNA位置。

N-氨基糖探针技术新用法:区分和量化土壤真菌和细菌固持无机氮速率

土壤微生物对无机氮的固持作用是构成土壤保氮机制的重要组成。作为土壤微生物的两大主要类群,真菌和细菌是微生物固持无机氮作用的主要参与者。然而,由于土壤微生物的高度复杂多变性,如何有效区分和量化土壤中真菌和细菌各自对无机氮的固持作用是个难题。针对该问题,本文采用"氨基糖稳定同位素探针(AS-SIP)"技术来区分和表征土壤中真菌、细菌各自对无机氮的固持速率。基于此进一步揭示了农业利用和外源碳输入分别对土壤真菌、细菌各自固持硝态氮作用的影响及原因,构建了土壤中真菌、细菌各自固持无机氮实际速率的估算模型,为区分和量化土壤中真菌、细菌各自对无机氮的实际固持速率提供了更为可信的新方法。本文介绍了AS-SIP技术原理、主要技术优势、应用案例、不足之处以及改进对策,以期推进该方法的应用和发展。