稳定性同位素探针技术在土壤功能微生物原位鉴定的应用

新近发展起来的稳定性同位素探针技术(SIP)与分子生物学方法结合,能够定向发掘复杂环境中参与特定生态过程的微生物资源,是土壤功能微生物原位鉴定的有效手段,具有广阔的应用前景。其原理是环境样品中的功能微生物代谢同化同位素标记的底物,通过对其生物标志物(即DNA、RNA、PLFA等)进行提取、分离、鉴定和比对分析,以此获取介导土壤物质转化和循环过程的功能微生物的直接信息。本文在分别介绍SIP技术在土壤功能微生物原位鉴定过程中的各种前处理方法、生物标志物选择及后续鉴定方法的基础上,综述了SIP技术在研究驱动土壤有机污染物生物降解、碳氮循环等过程的功能微生物原位鉴定的应用进展,展望了SIP技术在土壤微生物基因组学方面的应用前景。

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP(Stable isotope probing),是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。微生物的体积在μm尺度,因此,自然环境中微生物群落在μm尺度下生理过程的发生、发展,其新陈代谢物质在环境中累积与消减的动力学变化规律,形成了微生物生理生态过程,决定了不同尺度下生态系统物质和能量的良性循环。利用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA,实现了单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变,能在更高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源,推动微生物生理生态学和生物技术开发应用。本文重点探讨了DNA-SIP的技术原理、主要技术瓶颈及对策,初步展望了DNA-SIP为基础的环境微生物基因组学发展趋势。

水稻土好氧甲烷氧化菌对大气CO_(2)浓度升高的适应规律

CH4是仅次于CO_(2)的第二大温室气体,而稻田是CH4的主要排放源,未来大气CO_(2)浓度升高情景下(elevatedCO_(2),eCO_(2)),水稻土好氧甲烷氧化过程及其功能微生物群落适应规律尚不清楚。依托中国FACE(FreeAir CO_(2) Enrichment)水稻田试验平台,通过13C-CH4示踪的室内微宇宙培养实验,采用稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)和高通量测序技术,研究未来大气CO_(2)浓度升高对水稻土甲烷氧化活性及其功能微生物的影响规律。结果表明:与常规大气CO_(2)浓度(ambient CO_(2),aCO_(2))相比,eCO_(2)条件下的甲烷氧化活性显著增加,从243 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1)增加至302 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1),增幅高达24.3%,甲烷氧化菌数量则增加了1.1倍~1.2倍。通过超高速离心获得活性甲烷氧化菌同化13CH4后合成的13C-DNA,高通量测序发现,未来大气CO_(2)升高情景下水稻土活性好氧甲烷氧化微生物群落极可能发生明显演替,与对照相比,类型I甲烷氧化菌甲基杆菌属Methylobacter的相对丰度增加16.2%~17.0%,而甲基八叠球菌属Methylosarcina的相对丰度下降4.7%~11.1%;同时刺激了食酸菌属Acidovorax和假单胞菌属Pseudomonas等非甲烷氧化菌的活性。综上所述:未来大气CO_(2)升高情景下,水稻土好氧甲烷氧化微生物群落结构发生分异,促进了甲烷氧化通量,而甲烷氧化的代谢产物可能引发土壤中微生物食物网的级联反应,是土壤碳储存和周转的重要功能微生物群。

油气微生物分子勘探技术与初步应用

油气微生物勘探技术因其多解性小、信噪比高、受环境影响小、经济快速的特点,越来越受到勘探家的重视。随着高通量测序、分子生物学技术及生物信息学的快速发展,从微生物群落整体的角度描述特定油气指示微生物的变化,已成为未来微生物勘探技术的重要发展方向。介绍土壤样品采集、DNA提取与分析、判别模型建立和有利区预测等4个油气微生物分子勘探技术关键环节,并针对土壤DNA提取和油气指示微生物检测进行重点阐述。工业级DNA提取技术研究发现,Griffth方法提取并纯化土壤微生物DNA效果最佳。针对大样本量工程,使用高通量移液工作站和商用多孔板DNA抽提试剂盒可大幅提高勘探效率;综合稳定性同位素探针和高通量测序的分子检测技术研究探明了典型含油气区主要油气指示微生物菌种分布规律,高频油指示菌(AMNR族)为节杆菌、分枝杆菌、诺卡氏菌和红螺菌,高频气指示菌为甲基球菌、甲基杆菌、甲基孢囊菌。微生物分子勘探技术在鄂尔多斯盆地杭锦旗地区的初步应用表明,该技术在黄土塬地貌区油气识别精度显著提升,在含油气性评价方面效果良好,为鄂尔多斯盆地北部致密气有利区带筛选提供了参考依据。

稻田生物固氮研究进展及方向

稻田淹水产生的合适pH和氧化-还原条件为固氮微生物的固氮提供了适宜环境条件,使得稻田在多年不施氮肥条件下仍能维持一定产量,而旱地产量则逐年下降。随着化学氮肥用量的增加,导致了严重的环境污染,迫切需要增加生物固氮来保证粮食生产和减少环境污染。为发挥稻田生物固氮功能,我们对稻田生物固氮的研究方法、固氮量、固氮微生物、影响因素、调控及其研究方向进行综述,以期为稻田生物固氮研究提供参考。

植物光合碳在根际土壤中的微生物转化与SIP技术

光合碳是"大气-植物-土壤"系统碳循环的重要组成部分,也是土壤有机碳的重要来源。根际土壤微生物在植物光合碳转化过程中起到关键作用。由稳定性同位素标记技术与分子生物学技术相结合发展起来的稳定性同位素探测技术(stable isotope probing,SIP),可确定参与碳转化的微生物群落结构和功能,以及复杂群落中微生物相互关系,在研究有机碳和微生物相互作用关系方面具有广阔的应用前景。简要概述了光合碳在植物地下部的分配,总结了根系分泌物和微生物之间的关系,介绍了利用PLFA-SIP、RNA-SIP和DNA-SIP技术研究碳转化相关微生物的优势,提出了该技术目前存在的一些问题,展望了其在微生物生态研究上的应用。

DNA-SIP鉴定甘蔗//大豆间作土壤^(15)N-DNA富集位置的氮循环功能基因qPCR方法

为筛选有效鉴定甘蔗//大豆间作系统的稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP)中超高速离心后15N-DNA富集位置的指示功能基因,利用实时荧光定量PCR技术(qPCR),检测6个氮素循环功能基因在不同浮力密度离心液DNA中的相对丰度分布,通过对氮素循环功能基因相对丰度作图分析,nifH和amoA基因在甘蔗//大豆间作和大豆单作种植模式中15N标记组与对照组基因丰度峰发生偏移,chiA基因丰度峰仅在大豆单作种植模式下存在偏移,而nirS、nirK、nosZ等3个基因的丰度峰值在两种种植模式下均不发生偏移。结果表明nifH和amoA基因可作为指示基因,能够有效鉴定甘蔗//大豆间作系统中DNA-SIP技术15N-DNA位置。

青枯病导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落差异分析

【目的】探明导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落演替规律,为研究连作障碍发生的微生物机制奠定基础。【方法】通过“限微模拟宇宙系统”,采用稳定同位素核酸探针(DNA-SIP)技术标记氮来源,利用宏基因组高通量测序技术开展导病抑病植烟根际土壤氮循环微生物特征分析,并建立特征微生物与烟叶品质、产质量、青枯病发病状况等表观数据的相关性。【结果】导病抑病土壤中参与氮素循环的微生物种类具有差异,导病与抑病土壤中受根系分泌物调控的特有微生物分别为受土壤本身影响微生物数量的63.9%和1.29倍;在根系分泌物介导下,导病土壤中与氮循环相关的物种群落主要为变形菌门(Proteobacteria),主要上调与细胞运动和转运有关的基因;抑病土壤中主要为放线菌门(Actinobacteria),主要上调与物质转运与代谢有关的基因。导病与抑病土氮循环微生物具有显著差异的物种为硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和木纹杆菌门(Lgnavibacteriae);抑病土壤中与质量指标间存在极显著相关关系的微生物属比导病土壤少21.7%,但抑病土壤微生物与烟叶品质关键指标茄酮间关联性是交叉互作的,显著相关比例较导病土提升19.3百分点。【结论】根系分泌物主要影响导病土壤与氮素循环相关的微生物,土壤本身的性状主要影响抑病土壤氮素循环相关微生物,即导病土壤微生物易受作物的影响发生病害;抑病土壤通过调控土壤微生物对烟叶质量的影响,保持烟叶质量的稳定状态。