新一代高通量测序与稳定性同位素示踪DNA/RNA技术研究稻田红壤甲烷氧化的微生物过程

【目的】利用新一代高通量测序技术分析复杂土壤环境中整体微生物群落结构的变化规律,研究特定功能微生物生理过程的分子机制;利用稳定性同位素示踪微生物核酸DNA/RNA,研究复杂土壤中关键元素转化的微生物调控机制。【方法】针对我国第四纪红色粘土母质发育的3种稻田红壤,围绕13C-甲烷好氧氧化的微生物过程,在DNA和RNA水平高通量测序土壤微生物群落16S rRNA基因和16S rRNA,通过超高速密度梯度离心土壤微生物总核酸获得13C-标记的DNA/RNA,进一步采用克隆文库技术研究稻田红壤甲烷好氧氧化的微生物作用者。【结果】新一代高通量测序结果表明,3种稻田红壤甲烷的好氧氧化过程中,甲烷好氧氧化菌占土壤整体微生物群落的丰度显著增加,RNA水平的增幅显著高于DNA水平,能够更为灵敏地反映土壤甲烷好氧氧化的微生物过程。3种稻田红壤甲烷的好氧氧化过程中,类型Ⅰ和类型Ⅱ甲烷好氧氧化菌在湖南古市土壤中显著增加,湖南桃源土壤中类型Ⅱ甲烷好氧氧化菌增加明显,而类型I甲烷好氧氧化菌在广东雷州土壤中增幅最大。进一步利用13C-DNA和13C-RNA分别构建pmoA基因和16S rRNA克隆文库,发现类型I甲烷好氧氧化菌主导了湖南古市和广东雷州稻田红壤甲烷的好氧氧化过程,类型II甲烷好氧氧化菌主导了湖南桃源稻田红壤甲烷的好氧氧化过程。【结论】新一代高通量测序技术能够在整体微生物群落水平,清楚反映复杂土壤中特定功能微生物的生理生态过程,而RNA较DNA水平的分析更为灵敏;稳定性同位素示踪微生物核酸DNA/RNA技术能够准确地揭示复杂土壤重要过程的微生物作用者。

基于核酸DNA/RNA同位素示踪技术的水稻土甲烷氧化微生物研究

稳定性同位素示踪复杂土壤中微生物DNA/RNA的技术难点是13C-DNA/RNA的鉴定。本研究针对我国六种典型水稻土,利用稳定性同位素13CH4示踪活性的甲烷氧化菌,超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA/RNA后,以甲烷氧化菌独有的pmo A功能基因和16S r RNA特异基因作为分子标靶,通过半定量凝胶电泳技术评价了特异基因作为分子标靶判定13C-DNA/RNA的可行性,进一步利用克隆文库技术研究水稻土中的活性甲烷氧化菌群落结构。结果表明:甲烷氧化菌功能基因pmo A作为分子标靶,能够准确鉴别13C-DNA,而甲烷氧化菌特异的16S r RNA基因则能较好地区分12C和13C标记的RNA,但13C-RNA中的非目标微生物污染高于13C-DNA示踪技术。进一步以13C-DNA和13C-RNA为模板,分别构建了pmo A和16S r RNA基因的克隆文库,系统发育分析表明I型菌主导了土壤甲烷氧化过程,其中江西鹰潭和黑龙江五常土壤中活性甲烷氧化菌全部属于Ia型,而四川资阳、浙江嘉兴、江苏常熟和江都土壤中Ia型和Ib型甲烷氧化菌均有发现,并且后者比例较低。这些结果表明分子标靶基因能够有效判定复杂土壤中的甲烷氧化菌13C-DNA/RNA,在DNA和RNA水平的结果基本一致,我国典型水稻土中活性甲烷氧化菌可能存在一定的地理分异规律。

海洋沉积物中深古菌的固碳潜能——基于DNA的稳定性同位素示踪研究

深古菌分布广泛、生境多样,是地球丰度最高的微生物之一,被认为在全球碳循环中扮演着重要角色.由于分离培养困难,深古菌的生理代谢功能尚不清楚.前期研究表明,深古菌具有降解木质素的功能;宏基因组分析也表明深古菌包含完整的无机碳固定途径(Wood-Ljungdahl pathway,WL途径),但尚未有直接的功能验证报道.本研究利用木质素与NaH^(13)CO_(3)对海洋沉积物样品进行长期培养,探究深古菌固定无机碳的能力.结果表明:在添加了木质素的培养体系中深古菌持续增长,10个月后其丰度增幅高达15.3倍,并在古菌中占比由30%上升为80%.为查明培养体系内微生物的固碳功能,监测了总有机碳δ^(13)C随时间的变化,发现两种添加了NaH^(13)CO_(3)的体系的总有机碳在最初的一个月均有升高,随后在未添加木质素的体系中基本保持不变,而添加了木质素的体系中δ^(13)C缓慢而持续地增长.对培养过程中不同处理和不同阶段的样品进行DNA提取,并通过超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA后,利用Q-PCR分析其中深古菌与细菌的16S rRNA基因丰度.发现4个月后添加了木质素和NaH^(13)CO_(3)的体系中深古菌16S rRNA基因相较于细菌更明显集中出现在密度更重的层位,说明深古菌通过利用木质素和固定NaH^(13)CO_(3)大量增殖并导致其DNA被^(13)C标记,深古菌具有固碳代谢的能力.

同位素示踪法在“细胞代谢”中的应用

同位素示踪法在高中生物学教材中有多处涉及,在历年的高考试题中经常作为背景材料。同位素示踪法是生物学实验中的一项重要方法,它可以研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等,进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。本文仅对同位素示踪法在'细胞代谢'中四方面的应用进行例析,希望能帮助同学解决相关的疑难问题。

不同水分条件下格陵兰岛冻土活性甲烷氧化菌群落分异规律

揭全球气候变化导致丹麦格陵兰岛形成了旱地和间歇淹水的土壤景观,采用稳定性同位素核酸探针技术和高通量测序16S r RNA及pmoA基因的分析方法,开展了格陵兰岛旱地和间歇淹水土壤微宇宙培养试验,探究不同水分条件下冻土的甲烷氧化潜力及活性好氧甲烷氧化菌群落演替规律。结果表明:与旱地土壤相比,淹水土壤氧化高浓度甲烷的速率呈现降低趋势,分别为12.38和12.17μg/(g·d),但后者对甲烷碳同化利用效率显著高于前者,土壤13C-有机碳原子百分比从自然丰度1.08%,分别增加至1.64%和1.99%。超高速密度梯度离心分析13C-DNA发现甲烷氧化菌群落发生演替,旱地土壤中Crenothrix甲烷氧化菌16S rRNA基因丰度仅为0.04%,而在间歇淹水土壤中为23.78%,增幅高达557倍;类型Ⅱ甲烷氧化菌Methylosinus则从33.76%增至44.38%。然而,类型Ⅰ甲烷氧化菌Methylocaldum的丰度明显降低,从旱地土壤10.15%显著降低为间歇淹水0.14%;进一步通过pmo A基因高通量测序分析,也得到了类似的结果,特别是类型Ⅰ甲烷氧化菌RPCs从旱地土壤15.61%显著降低至间歇淹水土壤的0.13%。这些结果表明:尽管格陵兰冻土中经典的类型Ⅱ甲烷氧化菌主导了旱地土壤和间歇性淹水土壤好氧甲烷氧化过程,但水分可能是甲烷氧化菌群落演替的重要环境驱动力,水分增加导致活性的类型Ⅰ种群丰度降低,同时显著刺激了新型甲烷氧化菌Crenothrix的大量生长并可能在间歇淹水土壤中发挥了重要作用。