稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论:成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。

pEGFP-N1-NUCB2真核表达质粒的构建及在SH-SY5Y细胞中的转染效率

目的构建p EGFP-N1-NUCB2重组子并比较Lipofectamine 2000和Xfect两种转染试剂在进行神经细胞转染时的转染效率。方法构建p EGFP-N1-NUCB2重组子,然后采用碱裂解法进行质粒DNA的提取,PEG-Mg Cl2进行质粒DNA的纯化,最后将纯化的质粒DNA分别用两种不同转染试剂分别在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中进行转染。结果采用Lipofectamine 2000进行p EGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在HEK293细胞中可以转染成功,但是在SH-SY5Y细胞中基本没有荧光显现;采用Xfect进行p EGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在SH-SY5Y细胞中虽有荧光显现,但是转染效率非常低。结论 Xfect的转染效率高于Lipofectamine 2000,p EGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y细胞中采用脂质体进行转染很难成功。

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。

5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞应激损伤的保护作用

目的探究5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞(APPsw细胞)氧化应激损伤的保护作用。方法将APPsw细胞传代培养24 h后,加入不同浓度(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)的A7预处理24 h,再加入200μmol·L^-1过氧化氢(H 2 O 2)继续培养24 h,用MTT法检测细胞活性,用Hoechst染色法检测细胞凋亡,用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7可剂量依赖性地增加过氧化氢处理后的细胞活力,经不同浓度的A7预处理后,加过氧化氢处理组的细胞活性明显低于对应单独A7处理组的细胞活性,但均高于单独过氧化氢处理组的细胞活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。经不同浓度A7预处理后,加过氧化氢处理组与过氧化氢组比较细胞核中荧光显著变暗。过氧化氢组细胞早凋率为42.4%,A7(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)预处理24 h后加过氧化氢处理组细胞早凋率分别为22.7%,19.9%,16.4%和15.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导APPsw细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抑制细胞凋亡。

稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流。方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白。将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348。慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系。诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析。Western blot检测目的蛋白表达情况。结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体。无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001)。Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带。结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础。

稳定表达野生型PINK1蛋白SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(AREP)PINK1基因真核表达载体,建立稳定表达PINK1蛋白的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增PINK1基因全长cDNA编码区序列,重组DNA技术定向插入真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)B,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,挑选出稳定转染的单克隆株,经提取gDNA进行PCR扩增、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表达。结果成功构建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表达载体,稳定转染SH-SY5Y细胞后,经提取gDNA扩增、RT-PCR及Westernblot检测到了野生型PINK1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达。结论构建了PINK1基因真核表达载体和稳定表达PINK1蛋白的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究PINK1基因功能及AREP发病机制提供了一个转基因细胞模型。

人参二醇对APP-SH-SY5Y细胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信号通路的影响

目的:研究人参二醇(PD)对转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(APP-SH-SY5Y)中Tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制。方法:采用分子对接技术验证PD与非受体酪氨酸激酶Fyn的靶向性。在体外培养SH-SY5Y细胞,构建APP-SH-SY5Y细胞模型和绿色荧光蛋白(GFP)-SH-SY5Y细胞模型(对照细胞),通过检测细胞中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的表达来验证APP-SH-SY5Y细胞模型是否构建成功。以GFP-SH-SY5Y细胞为对照,采用CCK-8法检测5、10、20、30、40μmol/L的PD和125、250、500、1000、2000 nmol/L的PP2(Fyn抑制剂,阳性对照)作用24 h对APP-SH-SY5Y细胞存活率的影响,以确定最佳给药浓度。以APP-SH-SY5Y细胞为对象,分别检测最佳浓度PD、PP2作用24后细胞中Ca2+浓度及磷酸化Tau蛋白(p-Tau)/Tau、磷酸化非受体酪氨酸激酶Src(p-Src)/Fyn、磷酸化谷氨酸受体2B(p-GluN2B)/GluN2B比值。结果:分子模拟对接结果显示,PD可靶向结合Fyn蛋白。与GFP-SH-SY5Y细胞比较,APP-SH-SY5Y细胞中Aβ1-42蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。PD和PP2的最佳作用浓度分别为20μmol/L和500 nmol/L。20μmol/L PD、500 nmol/L PP2均可显著升高细胞的存活率,显著降低细胞中Ca2+浓度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。结论:PD可通过抑制Fyn/GluN2B信号通路来降低APP-SH-SY5Y细胞中Ca2+浓度及Tau蛋白的磷酸化水平。

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的 构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法 采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果 大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论 真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。

三种非病毒载体对神经母瘤细胞进行转染的效果比较

目的以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,研究Lipofectamine2000、改良纳米材料CS(N/P=10)和纳米粒子PAMAM(N/P=20)介导的基因导入系统对神经母瘤细胞SH-SY5Y的毒性及基因转染效率,为神经系统疾病的基因治疗奠定基础。方法制备Lipofectamine2000、CS和PAMAM与质粒DNA(pDNA)的复合物,分别转染在体外培养的人胚肾细胞Hek293和SH-SY5Y,利用噻唑蓝(MTT)比色实验比较三种载体的细胞毒性作用、用激光共聚焦显微镜观察转染后的细胞形态、倒置荧光显微镜检测转染细胞EGFP表达强度、流式细胞仪检测转染效率。结果①Lipofectamine2000、CS和PAMAM转染细胞存活率在Hek293细胞分别为73.09%、73.69%、69.24%,三者比较无显著差异;在SH-SY5Y细胞分别为67.69%、61.71%、42.92%,前两者均显著高于后者(P均<0.05)。②Hek293细胞经Lipofectamine2000和CS与pDNA的复合物分别转染后,细胞形态均未发生明显改变,保持梭状生长;而PAMAM/pDNA复合物转染后,细胞发生皱缩,呈圆形分布生长。经三种载体转染后的SH-SY5Y细胞均发生形态改变,其中PAMAM/pDNA复合物转染者形态改变程度相对较大。Hek293细胞和SH-SY5Y细胞中,均以Lipofectamine2000/pDNA复合物转染者EGFP表达强度最大,其次为CS/pDNA复合物、PAMAM/pDNA复合物转染者。④Lipofectamine2000、CS和PAMAM的转染效率在Hek293细胞分别为60.9%、45.2%、42.7%,前者显著高于后两者(P均<0.05);在SH-SY5Y细胞分别为25.3%、19.2%、8.9%,前两者均显著高于后者(P均<0.05)。结论 Lipofectamine2000为目前最适于神经系统疾病基因治疗研究的非病毒载体;改良后的新纳米材料CS毒性比PAMAM小、转染效率比PAMAM高,有望在神经系统疾病研究中得到进一步运用。

A20基因在神经母细胞瘤细胞系中的抗凋亡作用

目的A20基因是一种肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导下的原始反应基因。其编码的锌指结构蛋白在抑制NF-κB和TNF-α介导的细胞凋亡方面得到了广泛的研究。但对于其在神经系统中的作用研究较少。该实验采用脂质体转染及克隆筛选将A20基因导入神经母细胞瘤(SY-SH-5Y细胞系)中,通过体外实验观察A20-SY-SH-5Y细胞在抗凋亡方面的表现。方法SY-SH-5Y细胞系转染A20基因后,应用肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激,采用流式细胞仪(FACS)测定细胞的死亡率,并进行DNA片断化分析(DNA Ladder)。结果实验表明:转染A20的SY-SH-5Y细胞系在TNF-α的诱导下死亡率小于对照组转染pCDNA3基因的SY-SH-5Y细胞系(P<0.05)。结论A20作为一种在细胞抗凋亡过程中发挥关键作用的基因,能够在神经母细胞瘤SY-SH-5Y细胞系中表现出较强抗凋亡能力,为临床上许多以凋亡为主要表现的神经系统疾病的治疗提供了新思路。

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。

神经细胞粘附分子在不同细胞株转染表达效果的比较

目的:以表达神经细胞粘附分子(NCAM)亚型的质粒转染不同细胞株,并对转染效果进行比较。方法:使用FuGENEHD Transfection Reagent、LipofactaneTM2000对SH-SY5Y细胞株、HEK293细胞株转染以T4为载体的NCAM亚型表达质粒,通过免疫荧光法和Western Blot法检测转染效果。结果:Western blot法检测转染48h后蛋白表达情况:SH-SY5Y细胞转染T4-NCAM180、T4-NCAM140质粒后无NCAM亚型目的蛋白高表达,HEK293细胞转染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120质粒后显示出HEK293细胞可高表达NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白。结论:对SH-SY5Y细胞未能转染NCAM亚型表达质粒,对HEK293细胞能转染NCAM亚型表达质粒。

Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建

目的:构建Parkin基因过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞,为进一步研究帕金森病的发病机制及中药的作用环节奠定基础。方法:首先构建Parkin基因过表达质粒,采用脂质体转导技术,将Parkin过表达质粒应用Lipo3000转染SH-SY5Y细胞。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR检测其Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测其Parkin蛋白的表达。结果:转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达;Parkin过表达细胞Parkin mRNA和蛋白的表达均显著提高(P<0.01)。结论:通过脂质体转导技术,应用Lipo3000可将Parkin过表达质粒成功转染入SH-SY5Y细胞,转染的基因和蛋白表达均较高,提示此法可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型。