前白蛋白cDNA的克隆及稳定转染细胞株的建立

建立真核表达重组体 pCDNA3 1(+) -PA的稳定转染细胞株。以人胚肝组织总RNA为模板通过RT-PCR获取全长PAcDNA。先将该序列克隆到 pGEM -TEasy载体 ,再亚克隆转入pCDNA3 1(+) ,限制性内切酶消化及DNA序列分析鉴定重组体构建正确后 ,用脂质体转染技术把它导入Hela细胞 ,经G4 18筛选建立稳定转染细胞株 ,真核表达重组体 pCDNA3 1(+) -PA构建成功 ,稳定转染细胞株中有PAcDNA表达。

雌二醇依赖性细胞稳定转染克隆株的研究

利用已经构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的表达载体和一个含有鸡溶菌酶基因超敏感位点4(hypersensitivity site 4)的载体pBS-HS4,采用Polybrene的方法进行稳定共转染T47D细胞得到稳定转染细胞株,结果得到了87株稳定转染细胞株。用10-9mol/L 17β-雌二醇诱导筛选,结果标号为EGFP-T47D 74的克隆细胞株在诱导后72 h及96 h表现出非常强的诱导荧光,而且诱导倍数较大,为3.63倍。结果表明,试验筛选出的稳定转染重组细胞株可供进一步建立细胞表达系统来筛选EEDCs。

锌带蛋白(ZNRD1)小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为探讨以锌带蛋白(ZNRD1)基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,以Western blot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和耐药相关蛋白P-gp,MRP的表达变化。结果表明,ZNRD1在HL-60/ VCR细胞中的表达明显高于HL-60细胞;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达P-gp 和Bcl-2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用

基于细胞划痕实验研究了DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。首先采用实时定量PCR检测人胃粘膜细胞GES、胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平,确定DDX20基因高表达和低表达细胞株;进而针对DDX20基因设计、包被过表达并干扰慢病毒,基于实时定量PCR和Western Blot筛选稳定转染细胞株;基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果显示,与正常的胃粘膜细胞GES相比,DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高、MKN74胃癌细胞中表达水平次之、SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著增加;转染DDX20干扰慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著降低,特别是转染干扰组2干扰慢病毒。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移,抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结果表明,DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因,通过抑制该基因的表达能有效降低肿瘤细胞的迁移,为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点,具有一定的临床应用价值。

DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用

目的:基于细胞划痕实验研究DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。方法:首先采用实时定量PCR检测人胃黏膜细胞GES,胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平,确定DDX20基因高表达和低表达细胞株;进而针对DDX20基因设计并包装过表达及干扰慢病毒,基于实时定量PCR和Western印迹筛选稳定转染细胞株;基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果:与正常的胃黏膜细胞GES相比,DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高,在MKN74胃癌细胞中表达水平次之,在SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著增加;转染DDX20干扰慢病毒,特别是sh-RNA-02干扰慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著降低。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移,抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结论:DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因,通过抑制该基因的表达能有效降低细胞的迁移,为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点,具有一定的临床应用价值。