基因干预MST2的施万细胞稳转株建立及其在线粒体膜电位检测的应用

目的构建稳定敲低及过表达哺乳动物Ste20样激酶2(mammalian ste20-like kinase 2, MST2)的大鼠施万细胞株,并初步探讨MST2对线粒体膜电位的调控作用。方法 大鼠施万细胞株(RSC96)分为正常对照组(对照组)、氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)模型组、MST2敲低对照组、MST2敲低组、MST2过表达对照组、MST2过表达组。逆转录PCR法扩增大鼠Mst2基因全长序列,构建过表达Mst2基因的慢病毒表达载体重组质粒并鉴定。使用第二代慢病毒包装系统获取Mst2基因敲低及过表达的慢病毒毒液,并分别感染RSC96细胞株,建立基因干预MST2的稳转株。实时荧光定量PCR结合western blot检测基因干预效率,光镜结合S100荧光染色观察稳转株形态学变化。使用OGD模型处理细胞,以线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP)。结果 经测序分析,成功构建Mst2慢病毒表达载体重组质粒。施万细胞稳转株具有施万细胞的形态特征,并且表达施万细胞特异性标志物S100。在慢病毒感染的施万细胞,MST2表达在mRNA及蛋白水平上均较对照组有稳定且显著的差异,敲低效率超过90%,过表达约为对照组的40倍。稳转株在OGD模型中,对于MST2蛋白的基因干预仍然维持稳定。OGD可显著增加MST2蛋白表达,并降低施万细胞MMP,提示线粒体功能受损;而敲低MST2则显著改善MMP。结论 本研究成功构建了稳定敲低及过表达MST2的大鼠施万细胞株,并且在OGD模型中,敲低MST2可改善线粒体膜电位,提示其对线粒体具有保护作用。

人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究

目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。

TOE1敲低和过表达稳转细胞系的构建及其在胃癌细胞中的定位分析

TOE1(target of Egr1)是DEDD家族脱腺苷酸化酶Caf1新发现的一个同工酶。构建TOE1敲低和过表达的稳转细胞系,并分析其在细胞内的定位,可为进一步研究TOE1基因的功能提供基础。首先将靶向沉默TOE1基因的shRNA序列插入慢病毒载体pLVX-shRNA2-Puro,构建敲低TOE1基因的慢病毒载体pLVX-shTOE1。然后通过PCR扩增TOE1基因序列克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,构建TOE1基因过表达的慢病毒载体pCDH-TOE1。同时构建pEGFPTOE1真核表达载体,转染人胃癌细胞SGC-7901,激光共聚焦显微镜观察TOE1的亚细胞定位。慢病毒包装完成后分别感染SGC-7901细胞,用嘌呤霉素筛选稳定沉默TOE1的细胞系SGC-7901-shTOE1和稳定过表达TOE1的细胞系SGC-7901-oeTOE1,接着通过RT-qPCR和Western blot技术分别验证稳转细胞系中TOE1在mRNA和蛋白水平的表达水平。鉴定结果表明,SGC-7901-shTOE1细胞中TOE1的表达量显著降低,SGC-7901-oeTOE1细胞中TOE1的表达量明显升高,提示TOE1敲低和过表达的SGC-7901胃癌稳转细胞系构建成功。激光共聚焦显微镜观察结果显示,TOE1定位在细胞核中。研究结果为后期深入探究TOE1在胃癌中的功能以及作用机制奠定了基础。

KLF2过表达及敲减胃癌稳转细胞株的建立

目的构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到Age I/Age I酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到Bam HI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上,经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果利用慢病毒介导,重组质粒G V358-K L F2和K L F2-shRN A转导入B G C823细胞、M G C803细胞并稳定表达。RT-PC R和W estern印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高(P<0.05),敲减稳转株KLF2表达量明显下降(P<0.05)。结论成功构建了K L F2过表达B G C823细胞株和K L F2敲减M G C803细胞株,为后续K L F2功能实验奠定了基础。

Nrf2过表达与敲减Hep1-6稳转细胞株的建立

核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一个重要靶点分子。为了从体外研究小分子通过靶向Nrf2改善NAFLD的分子机制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO空载体得到重组载体p Lenti6/V5-Nrf2,通过测序、酶切鉴定正确后,扩繁质粒,制备慢病毒并将其感染Hep1-6肝癌细胞,用稻瘟醇胚素筛选、鉴定获得稳定表达Nrf2的细胞株。同时,用Nrf2干扰质粒构建慢病毒感染Hep1-6肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选、鉴定Nrf2敲减的细胞株。Q-PCR检测结果显示,过表达稳转株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表达量为对照组(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲减稳转株中Nrf2基因的表达量大幅度降低。Western blotting显示过表达稳转株的Nrf2表达量明显高于对照组,敲减稳转株的Nrf2表达量明显低于对照稳转株,此结果与Q-PCR结果一致。所克隆的Nrf2基因和敲减基因在Hep1-6小鼠肝癌细胞中得到了正确转录和翻译,稳转细胞株构建成功。

DcR3-RNAi-SW480结肠癌稳转细胞模型的建立及方法优化

目的建立靶向沉默诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)基因表达的DcR3-RNAi-SW480稳转细胞系,并对其条件及方法进行优化。方法构建靶向沉默DcR3基因的siRNA质粒表达载体,转染SW480细胞,并以G418及流式细胞仪筛选稳转细胞。实验分为3组:DcR3-RNAi稳转组、阴性对照组、空白对照组。蛋白质印记法(Western-blot)检测DcR3蛋白沉默情况。分别应用琼脂糖凝胶电泳、甲基噻唑基四唑(MTT)比色法、流式细胞术等方法对脂质体与质粒的比例、G418的筛选浓度、筛选的最佳方式等进行优化。结果 DcR3-RNAi稳转细胞组DcR3表达水平较对照组明显降低;在本实验室条件下,脂质体(μl)与DcR3-siRNA质粒(μg)最佳比例为3.5∶1;G418筛选浓度为800mg/L;G418联合流式细胞仪双筛的稳转细胞比例明显高于仅用G418单筛。结论成功建立特异性沉默DcR3基因表达的稳转DcR3-RNAi-SW480细胞系;G418联合流式是筛选稳转细胞较高效的方法;对转染及筛选的条件及方法进行优化,可提高转染与筛选效率。

以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法

目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP。将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P<0.01。结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。

G418选择与稳转克隆表达分泌hGM-CSF的相关性考察

目的：进一步考察不同Ｇ４１８维持用量与ｒｈＧＭ－ＣＳＦ表达水平相关性。方法：第２期历时３个月（第４～６个月），本室构建的ＣＨＯ－ｒｈＧＭ－ＣＳＦ稳转克隆，在不同Ｇ４１８维持用量（０、３００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ）下传２５代左右，各批次传代上清用依赖ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞作ＭＴＴ活性测定。结果：无Ｇ４１８选择维持，ＣＨＯ稳转细胞株表达和分泌ｈＧＭ－ＣＳＦ的水平从第４个月开始下降，再次加Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）后，ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达水平迅速回升，２周后至正常。结论：Ｎｅｏ抗性基因作为遗传选择标志进入真核细胞，上述结果对于选择Ｇ４１８用量以维持宿主细胞表达分泌目标蛋白具有一定参考价值。

慢病毒介导干扰LSD1基因的卵巢癌稳转细胞株的构建及鉴定

目的构建并鉴定慢病毒介导干扰赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)基因的卵巢癌稳转细胞株,为深入研究以LSD1为靶点的表观遗传学抗肿瘤治疗奠定基础。方法扩增并抽提所需质粒,紫外分光光度计检测质粒纯度,计算A260/A280。采用Lipofectamine 2000脂质体转染法将质粒转染入人肾上皮细胞293T,取转染THM质粒后的293T细胞,在倒置荧光显微镜下观察转染情况;分别取转染目的质粒和PLKO空载体质粒后的293T细胞,收集病毒上清液,感染人卵巢癌SKOV3细胞(分别记为观察组和对照组),筛选出稳转细胞株。观察组经浓度梯度(0、1、10、100、1 000 ng/m L)多西环素诱导,以及两组均经100 ng/m L多西环素诱导后,采用Western blotting法检测LSD1及其特异性反应底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量。结果目的质粒A260/A280在2.0左右,说明纯度较高;THM质粒转染293T细胞呈绿色荧光,为真核载体表达的绿色荧光蛋白,表明成功转染。随着多西环素浓度的升高,观察组诱导后LSD1蛋白相对表达量均逐渐降低,H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量逐渐升高,各浓度间比较有统计学差异(P均<0.01)。观察组经100 ng/m L多西环素诱导后LSD1蛋白相对表达量均明显低于同组诱导前及对照组诱导后,H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量明显高于同组诱导前及对照组诱导后(P均<0.01)。结论成功构建慢病毒干扰下调LSD1基因表达的卵巢癌稳转细胞株,并经不同浓度多西环素诱导鉴定;该细胞株可用于以LSD1为靶点的表观遗传学抗肿瘤治疗研究。

过表达/干扰表达miR-122对HBV稳转优势单克隆株HepGA14表达功能的影响

目的:采用miR-122过表达/干扰表达慢病毒质粒干预HBV稳转优势单克隆株HepGA14,观察其乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝病毒DNA(HBV DNA)表达功能的变化。方法:构建miR-122过表达和干扰表达慢病毒质粒,以最佳感染复数MOI值侵染HBV全基因组1.3倍体HBV稳转优势单克隆株HepGA14(对照组),分别命名为HepGA14-VL1044(miR122过表达组)和HepGA14-VL1043(miR122干扰组)。qPCR检测HepG2和HepGA14中的中miR-122的表达情况。ELISA分别检测3组细胞中上清HBsAg和HBeAg表达量,qPCR检测3组细胞的HBV DNA和miR-122表达水平。结果:最佳MOI值为30。与对照组比较,过表达miR-122慢病毒质粒侵染HepGA14后可上调优势细胞株内miR-122表达量,下调HBV DNA复制活性及HBsAg、HBeAg的表达量;干扰miR-122表达后,可上调HepGA14的HBV DNA复制活性及HBsAg、HBeAg的表达量,差异均有统计学意义(均P<0.0001)。结论:成功构建miR-122慢病毒过表达/干扰载体,并建立稳定过表达/干扰miR-122的HepGA14细胞系;miR-122可调控HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的表达水平。

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。

HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定

背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础.随着临床抗HBV治疗进入“功能性治愈”“完全治愈”新时代的趋势,对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA,cccDNA)转录机制,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切.HBV1.3倍(1.3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息,能依赖自身启动子启动转录过程,支持cccDNA形成和完整病毒复制,最接近于HBV体内感染状态下的生命周期.慢病毒转染是一种以慢病毒为载体,将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,可形成稳定转染.目的采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型,筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株.方法构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒;以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2,以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin,BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1.3-fold HBV-HepG2),继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列.将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆,通过测序各单克隆细胞的侧翼序列,以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置,再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平,筛选出最优势单克隆株.将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代,比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性.结果(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI=30的参数侵染HepG2细胞,72 h后加入BSD抗生素(终浓度1μg/mL)进行筛选,连续培养15-20 d后,获得1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞系,PCR鉴定出HBV DNA序列;(2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中,编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、HBeAg表达水平最高,分别为24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL,其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715,确定为优势单克隆株;(3)与HepG2.2.15细胞株比较,HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBsAg、HBeAg、HBx、HBV DNA、cccDNA,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论成功构建并筛选出1.3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14,这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础.

星形胶质细胞U251稳转FOXO1基因细胞系构建及其蛋白互作生物素验证

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是细胞生命活动的基础,以BioID和APEX为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究[1,2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氢键、盐键和疏水相互作用力进行,它们的空间距离都非常的短,所以通常认为互作的蛋白必定相互邻近[3]。TurboID是一种比BioID或APEX具有更高催化效率的蛋白质(标记时间从18 h缩短至10 min),由于很多蛋白发挥的结合与催化作用是很短暂的,理论上利用这个技术可以找到一些比较新颖的结合蛋白[4]。大量研究表明,FOXO1调控许多靶点,如参与细胞凋亡和自噬的基因、抗氧化酶、细胞周期阻滞基因以及代谢和免疫调节因子[5-6],被认为是一种具有复杂活性的超级转录因子。因此,我们将利用TurboID的高效性来寻找FOXO1的互作蛋白。

PTEN慢病毒过表达肝癌稳转株的构建及对Huh-7肿瘤活性的影响

目的构建过表达PTEN的人肝癌稳转细胞株,观察PTEN对肝癌细胞生物学行为的影响并探讨潜在机制。方法将编码PTEN的基因编码片段克隆到慢病毒载体pLV-puro-GFP,利用293T细胞得到慢病毒原液感染肝癌细胞Huh-7,嘌呤霉素筛选获得稳定过表达PTEN的Huh-7细胞。用RT-PCR、免疫荧光和Western blot法检测细胞内基因和蛋白的表达;Transwell检测细胞迁移活性;探讨AKT抑制剂MK2206对稳转株的药理作用。结果成功构建了PTEN过表达的肝癌稳转细胞株(Huh-7/hPTEN)。与对照株Huh-7/EGFP相比,Huh-7/hPTEN细胞PTEN的蛋白和mRNA表达升高(P<0.01),P53蛋白表达升高,Slug和AR的mRNA表达水平下降(P<0.01),HNF4α的mRNA表达升高(P<0.01),耐药蛋白ABCB1和ABCC2的表达下降,E-cadherin蛋白和mRNA表达升高(P<0.01),Vimentin的蛋白和mRNA表达下降(P<0.01),细胞迁移性能减少;Huh-7/hPTEN细胞对AKT抑制剂MK2206的利用率升高,并影响相关蛋白的表达。结论成功构建PTEN过表达肝癌稳转株,PTEN过表达可改善肝癌Huh-7细胞肿瘤生物学效应,致癌蛋白表达下降,迁移减弱。

JSRV-env慢病毒过表达载体的构建及BEAS-2B细胞稳转株的建立

通过构建过表达JSRV-env的慢病毒载体,筛选获得稳定表达Env的人支气管上皮细胞株(human bronchial epithelial cells-2b,BEAS-2B),检测Env对细胞增殖能力和迁移能力的影响。PCR扩增目的基因env,将其插入pMT194质粒中,构建pMT194-JSRV-env慢病毒过表达质粒,将重组质粒同包装辅助质粒混合后与转染试剂复合物共转染293T细胞。在收集、纯化浓缩病毒后,感染BEAS-2B细胞并优化感染条件。根据慢病毒载体携带的抗性基因puro,用嘌呤霉素(Puro)筛选稳定细胞株。通过qPCR和Western blot从转录和翻译水平检测目的基因表达,通过CCK-8检测细胞增殖能力和划痕试验检测细胞迁移能力。结果显示:目的基因env扩增成功,并将其重组插入pMT194载体,酶切鉴定与预期相符,pMT194-JSRV-env表达载体构建成功;转染293T细胞env表达量极显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.001),JSRV Env重组慢病毒平均滴度为1.03×10~9 IU/mL;慢病毒感染BEAS-2B细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为40,筛选细胞株的最佳Puro质量浓度为0.3 mg/L;荧光显微镜显示BEAS-2B细胞表达红色荧光;qPCR和Western blot检测结果均表明env表达量在试验组中极显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.001),Env-FLAG融合蛋白在宿主细胞成功表达;相较于空白对照组和阴性对照组,试验组细胞的增殖能力及迁移能力显著增强(P<0.05)。结果表明,成功构建JSRV-env慢病毒过表达载体,筛选出稳定表达Env的BEAS-2B细胞株,Env能够显著增加BEAS-2B细胞的增殖和迁移能力。

应用pCMV3-MdmX-RFP表达载体建立H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)稳转细胞系

[目的]探索应用pCMV3-MdmX-RFP表达载体构建H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)稳转细胞系。[方法]用KpnⅠ和NotⅠ双酶切后连接,构建pCMV3-MdmX-RFP表达载体并测序。重组质粒转染H1299p53R^(2)13X细胞,用100μg/mL的潮霉素B筛选2 w。将筛选出的细胞无限稀释后分到96孔板中,每孔一个单细胞,并扩增成单细胞群,选出荧光较强的3个细胞克隆(C1、C2和B4)采用Western Blotting和基因组PCR验证。将建立的稳定细胞系命名为H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)细胞系,用荧光显微镜观察稳转细胞系的第10代细胞,并用Western Blotting检测MdmX-RFP蛋白的表达情况。G418处理H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)细胞后,Western Blotting检测全长p53(full-length p53,FL-p53)和截断的p53(Truncated p53,TR-p53)蛋白表达水平。[结果]测序结果显示,重组质粒pCMV3-MdmX-RFP与数据库中的基因序列相同。稳定细胞系中MdmX-RFP蛋白的高表达,在第10代仍然如此。与对照组相比,用G418处理H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)细胞后,FL-p53蛋白水平升高1.6±0.12倍(P<0.05),TR-p53蛋白水平升高3±0.17倍(P<0.01)。[结论]构建的H1299^(p53R^(2)13X/MdmX)稳转细胞系过表达效率高,可直接用于后续实验。

Bcl-2修饰因子过表达及敲减A549稳转细胞株的构建

目的构建Bcl-2修饰因子(BMF)过表达及BMF敲减A549稳转细胞株。方法本研究为实验研究。根据BMF基因序列设计合成特异性引物并扩增目的基因,将其定向连接至经限制性内切酶BstBⅠ/SpeⅠ酶切后的GL159载体上,构建GL159-BMF重组质粒,经过筛选和测序鉴定后的阳性克隆转染293T细胞,包装慢病毒并测定病毒滴度。构建BMF-shRNA,连接到AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE载体上,经鉴定后转染293T细胞,包装慢病毒、测定病毒滴度,最终转染至A549细胞内。采用RT-PCR技术检测A549稳转细胞株BMF mRNA的表达情况。结果重组质粒GL159-BMF及BMF-shRNA在慢病毒的介导下转染至A549细胞内且稳定表达。RT-PCR检测结果表明:BMF过表达组的BMF mRNA表达量显著高于其对照组,差异倍数为986.23±35.47(P<0.001),BMF敲减组的BMF mRNA表达量显著低于其对照组,差异倍数为0.18±0.06(P<0.001)。结论成功构建BMF过表达及敲减A549细胞株,为后续BMF在慢性阻塞性肺疾病细胞凋亡机制中的研究奠定了基础。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

LL-37慢病毒过表达载体和RAW264.7-LL-37稳转细胞株的构建

目的构建LL-37慢病毒过表达载体,稳定转染RAW264.7细胞株,并检测LL-37在胞内mRNA和蛋白表达情况。方法根据GenBank数据库获取抗菌肽LL-37的蛋白编码基因序列,同时选择合适的酶切位点并设计特异性的上、下游引物,PCR扩增目的基因。用SalI、Age I限制性内切酶对载体和目的基因进行双酶切,将酶切目的片段与载体进行重组。重组质粒冰水浴30 min、42℃热激1.5 min、冰上放置2 min后转化入DH5α感受态细胞。将感受态细胞在不含氨苄的LB培养基中,37℃、200 r/min培养1 h。将转化菌在含氨苄平板上进行筛选,阳性菌落进行PCR和测序鉴定,鉴定正确的菌落进行扩增并大量抽提质粒。将20μg GV载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒与转染试剂混合后共转染293T细胞,收集细胞上清液,经离心、过滤后保存。将包装浓缩后的慢病毒按照MOI=100稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测转染成功的RAW264.7细胞中mRNA和蛋白表达情况。结果成功获得7487 bp的线性化载体和164 bp的LL-37PCR片段,成功构建LL-37慢病毒过表达载体。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中,经PCR和测序鉴定重组质粒构建正确。经包装浓缩后的慢病毒成功稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选出LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。RT-PCR检测携带重组质粒的慢病毒转染的RAW264.7细胞,胞内mRNA有良好表达丰度,LL-37基因的表达丰度为9074.883(P<0.01)。加入LL-37抗体的细胞株组在CQ1荧光拍照下能够观察到荧光,空白组和阴性对照组无此荧光,表明稳转LL-37 RAW264.7细胞株构建成功。结论成功构建LL-37慢病毒过表达载体并获得在胞膜及包浆均有大量表达LL-37的慢病毒稳转RAW264.7细胞株,为LL-37相关作用机制研究奠定了基础。

表达狂犬病病毒糖蛋白稳转细胞株的构建与应用

旨在利用Piggy Bac转座子系统构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)糖蛋白(glycoprotein,G)的稳转细胞株,为复制缺陷型RABV的拯救与培养奠定基础。根据NCBI公布的RABV SRV9株G基因序列设计引物,利用PCR技术扩增RABV-G基因并将其克隆至真核表达载体YHM-spCas9,构建重组质粒YHM-SRV9-G。将重组质粒与Piggy Bac转座子酶辅助质粒共转染BSR细胞,利用20 mg/L灭瘟素S盐酸盐(blasticidin)连续筛选2周后获得有抗性的细胞簇。利用有限稀释法连续2次单克隆纯化后获得稳定表达RABV-G蛋白的单克隆细胞株BSR-G。PCR、间接免疫荧光及Western blot鉴定结果显示,BSR-G细胞携带RABV-G基因并可表达G蛋白,激光共聚焦结果显示RABV-G蛋白定位在细胞膜。将缺失G基因的重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)分别感染BSR和BSR-G细胞,发现rSRV9-△G-eGFP可在BSR-G细胞中增殖。本研究成功构建了稳定表达RABV-G蛋白的稳转细胞株BSR-G,为狂犬病复制缺陷型基因工程疫苗的研制奠定了基础。