利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36的初步研究

通过优化PCR扩增体系,利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36。结果表明,利用扩增长片段的LA Taq酶,结合使用GC buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增,在退火温度为62℃和62.8℃时,得到了扩增效率较高,特异性高的16.5kb目标带。

普通野生稻稻瘟病抗性基因Pi36等位基因的克隆与序列分析

为了研究稻瘟病抗性基因Pi36的进化机理,以孟加拉国普通野生稻W39、马来西亚普通野生稻W40、印度野生稻L56为材料,对Pi36等位基因进行了克隆和序列分析。测序结果与已知的Pi36和测序品种日本晴以及"93-11"的基因序列进行比较。结果表明,编码区6个品种间的同源性为83%～99%,CC-NBS区域的同源性平均为91%;LRR区域为95%。并且还发现在野生稻W39和W40基因的第二个外显子区域有一个转座子插入。进化分析表明,6个品种从整体上分为3类,L56、日本晴和Pi36聚为一类,说明这3个品种的亲缘关系较近;W39和W40聚为另一类;"93-11"的基因聚为单独的一类,处于独立进化的模式。

稻瘟病抗性基因Pi36原核表达载体构建·表达与鉴定

[目的]研究稻瘟病抗性基因Pi36的结构和功能。[方法]利用双酶切构建Pi36基因CC、NBS结构域的原核表达载体,通过菌落PCR鉴定和测序验证阳性克隆。然后分别收集不同浓度IPTG诱导,不同温度30和37℃分别培养的大肠杆菌细胞提取蛋白,利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。[结果]当IPTG浓度为1mmol/L、30℃培养3h,目的蛋白表达量最大。[结论]为进一步研究稻瘟病抗性基因Pi36的抗病机理奠定基础。

稻瘟病抗性基因Pi36酵母表达载体的构建与表达

稻瘟病抗性基因Pi36编码卷曲螺旋核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列(CC-NBS-LRR)结构的抗病蛋白。为了深入研究该基因的结构和功能,试验利用双酶切构建了Pi36基因CC结构域的酵母表达载体,通过菌落PCR鉴定和测序验证阳性克隆。然后分别收集培养至不同OD值的酵母细胞提取蛋白,利用Western blotting检测目的蛋白的表达情况。结果表明,目的蛋白成功表达,并且在OD值为1.0的酵母细胞中表达量最大。

稻瘟病抗性基因Pi36的表达分析

为研究稻瘟病抗性基因Pi36的表达模式,利用半定量RT-PCR对抗病亲本Kasalath和感病亲本丽江新团黑谷(LTH)进行了接种前和接种后24 h和48 h的表达分析.结果表明:Pi36无论在接种前还是接种后以及无论在抗病亲本Kasalath还是感病亲本LTH中均有表达,并且各个时间段的表达量没有大的差别.由此说明,Pi36属于组成型而不是诱导型表达的基因.

江苏太湖地区粳稻稻瘟病抗性基因(Pi2、Pita、Pib)的分布及抗病效应

为分析稻瘟病抗性基因Pi2、Pita、Pib在江苏太湖地区粳稻稻瘟病抗性育种中的作用,利用五引物扩增受阻突变体系(PARMS)检测技术,检测水稻稻瘟病抗性基因Pi2、Pita、Pib在江苏太湖地区农业科学研究所筛选培育的799份高世代稳定试验材料中的分布情况,并结合穗颈瘟人工接种鉴定结果分析基因型与抗性的关系。结果表明,在799份供试水稻品种中,以抗性基因Pib的分布频率最高,抗性基因Pita的分布频率也相对较高,抗性基因Pi2分布频率较低,多数材料携带2个抗性基因;在抗性基因组合中,Pita+Pib组合检出率较高,为44.81%(358/799)。田间抗病性鉴定结果表明,当供试材料中只存在单一抗病基因时,中抗级别以上材料占比为33.60%(86/256),当供试材料中存在复合基因型时,中抗级别以上材料占比为61.02%(299/490),表明抗性基因共存可以有效增强植株对稻瘟病的抗性。本研究结果为江苏太湖地区粳稻稻瘟病抗性基因聚合育种的选择提供了理论支持。

华南籼稻骨干亲本稻瘟病基因检测与抗性评价

选用Pi2、Piz-t、Pi9、Pi25、Pi5、Pita、Pia、Ptr、Pi1、Pikm、Pi54等11个抗稻瘟病基因的功能性分子标记,对华南稻区近年育成的90个籼稻骨干亲本进行抗性基因鉴定与稻瘟病抗性评价。结果表明,综合抗性等级达到高抗、抗、中抗、中感、感及高感的亲本分别为0份、3份、35份、38份、14份和0份,且年度间表现较为一致。不同鉴定时期的稻瘟病抗性级别相关性分析进一步显示,苗瘟与叶瘟、苗瘟与穗颈瘟以及叶瘟与穗颈瘟的抗性级别呈极显著正相关。对上述11个抗性基因在90个亲本中的分布进行检测,发现除Pi9基因以外,其他10个抗性基因在亲本中的分布频率分别为75.56%(Pi54)、70.0%(Pi5)、47.78%(Pi2)、31.11%(Pi25和Pia)、20.0%(Ptr)、15.56%(Pi1)、13.32%(Pita)、4.44%(Pikm)和1.11%(Piz-t)。11个抗性基因在不同省际间育成亲本中的分布频率差异较大。进一步结果表明,随着聚合抗性基因数量的增加,亲本抗性水平呈相应提升趋势,但不同抗性基因组合对于提升水稻亲本抗病性的贡献呈现明显差异。本研究为华南稻区新育成籼型常规水稻品种的合理布局及抗稻瘟病基因的育种应用提供有益的参考。

水稻中八个稻瘟病抗性基因特异分子标记的开发及应用

【目的】为了明确水稻亲本的稻瘟病抗性基因组成,并有效地应用于水稻抗性育种,开发不受遗传背景限制的分子标记至关重要。这些分子标记能够精确地识别亲本中的抗性基因,为分子辅助育种提供重要的工具。【方法】发掘抗性基因编码区在155份水稻材料中等位基因的核苷酸多态性位点,在特异性最强位点开发分子标记。【结果】经多重阳性及阴性对照或部分结果的重测序检验,为Pit、Pish、Pib、Pid3、Pi5、Pia、Pi54和Pita2/Ptr等8个抗性基因开发了有效的分子标记,并明确这些抗性基因在109个四川盆地常用育种亲本中的组成。其中,Pia基因不存在于这些亲本中,Pit、Pish、Pi54、Pid3、Ptr/Pita2、Pi5和Pib基因分别存在于3.67%、13.76%、14.68%、18.35%、24.77%、26.61%和38.53%的亲本中。另外,有21.10%的水稻亲本不含这些基因,35.78%的亲本只含有1个抗性基因,43.12%的亲本聚合了2~4个抗性基因。

新发现一个稻瘟病抗性基因

近日,中国水稻研究所种质资源研究创新团队利用全基因组关联分析鉴定了一个水稻稻瘟病抗性基因,并通过遗传学及生理生化实验揭示其抗病分子机制。该研究有助于深入理解植物抗病分子模型,同时也为水稻抗病品种的选育提供理论参考。相关研究成果发表在《植物通讯(Plant Communications)》。

抗稻瘟病水稻恢复系的分子标记辅助选育及抗性鉴定

【目的】开展抗稻瘟病水稻恢复系的分子标记辅助选育及抗性鉴定,为育成持久、广谱抗病优质杂交水稻新品种提供优异的遗传资源和技术参考。【方法】利用分子标记辅助选择和回交育种技术,将持久、广谱的抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pigm导入恢复系桂R1703,获得了单基因、双基因和三基因导入系,并对其进行稻瘟病鉴定和农艺性状调查,分析不同抗稻瘟病基因间的抗性效应及抗性基因导入对受体亲本农艺性状的影响。【结果】通过对杂交后代和回交群体的Pi1、Pi2和Pigm基因相关分子标记检测,发现抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pigm已成功导入到桂R1703中,筛选获得7个携带有抗稻瘟病基因且抗性和农艺性状综合表现优良的导入株系,表现出较强的稻瘟病抗性。单基因导入系中,抗稻瘟病基因的抗性效应排序为为Pigm>Pi2>Pi1;双基因和三基因导入系的稻瘟病抗性均强于单基因导入系,尤其以三基因导入系抗性最强,不同基因聚合的抗性效应排序为Pi1+Pi2+Pigm>Pi2+Pigm>Pi1+Pigm>Pi1+Pi2。7个瘟病抗性基因导入株系与桂R1703在穗长和千粒重方面无显著差异(P>0.05,下同),有2个瘟病抗性基因导入系的株高显著高于桂R1703(P<0.05,下同);有1个瘟病抗性基因导入系的单株有效穗显著高于桂R1703;有3个瘟病抗性基因导入系的单穗总粒数显著高于桂R1703;有5个瘟病抗性基因导入系结实率显著低于桂R1703;有2个瘟病抗性基因导入系的单株产量显著低于桂R1703;有4个瘟病抗性基因导入系的单株产量显著高于桂R1703。【结论】通过分子标记辅助选育可有效聚合多基因(Pi1、Pi2和Pigm基因),使恢复系桂R1703的稻瘟病抗性得到明显提升,获得一系列抗稻瘟病且与亲本其他性状相近的遗传材料,可作为亲本材料用于选育抗病优质的杂交稻。

分子标记辅助选择Pi9基因改良水稻不育系桃农1A稻瘟病抗性

以籼稻品系75-1-127为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性InDel标记CoInDF_(1)R_(2)开展MAS回交育种以定向改良桃农1A稻瘟病抗性。分子标记CoInDF_(1)R_(2)在75-1-127基因组中扩增出1条大小为354 bp的条带,而在桃农1B和桃农1A基因组中扩增条带大小约为470 bp。分别以75-1-127与CO39作为抗病对照与感病对照进行室内人工接种,得到桃农1A、桃农1B及其改良不育系和保持系的抗菌谱,结果显示,75-1-127的抗性频率为86.67%,桃农1A与桃农1B的抗性频率均为6.67%,而改良不育系桃农1A-Pi9及其保持系桃农1B-Pi9的抗性频率同75-1-127,且田间病圃表现高抗苗瘟。经田间不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,育成1个高抗稻瘟病、不育性彻底且稳定、柱头外露率高、包颈粒率低、农艺产量性状优良的新不育系桃农1A-Pi9-1及其配套保持系桃农1B-Pi9-1,实现了桃农1A稻瘟病抗性的定向改良。

利用抗稻瘟病基因Pigm和抗纹枯病数量性状基因qSB-9TQ、qSB-11HJX改良南粳9108的抗性

【目的】稻瘟病和纹枯病是水稻两大重要病害,严重影响稻米的产量和品质。培育抗病品种是降低其危害最经济有效的措施。【方法】本研究结合分子标记辅助选择技术,将广谱抗稻瘟病基因Pigm和抗纹枯病数量性状基因qSB-9^(TQ)、qSB-11^(HJX)导入优良食味粳稻品种南粳9108中,构建不同抗性基因/基因组合的株系,并评价这些株系的稻瘟病和纹枯病抗性,考查其主要农艺性状和品质性状。【结果】导入Pigm能显著提高南粳9108对苗瘟和穗颈瘟的抗性;分别导入qSB-9^(TQ)、qSB-11^(HJX)均能提高南粳9108的纹枯病抗性,且两个抗性基因聚合时呈现一定的抗性累加效应。其中,导入Pigm的株系穗长和每穗粒数显著增加,导入qSB-11^(HJX)的株系千粒重显著增加,其他农艺及品质性状与南粳9108无明显差异。【结论】这些抗性基因导入/聚合能在不降低农艺及品质性状的同时,显著提高纹枯病和稻瘟病的抗性水平,为粳稻抗病育种提供新的种质资源。

Pi9基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

以携带广谱持久的抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75–1–127为供体亲本,以保持系金23B及其不育系金23A为受体亲本,采用Pi9基因共显性标记CoInDF1R2进行MAS回交育种,以改良三系不育系金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性;用25份稻瘟菌代表性菌株进行室内苗瘟接种,观察苗瘟抗性表现。结果显示:金23A和金23B的抗性频率仅为28%,而75–1–127的抗性频率为92%;田间病圃抗性鉴定结果显示,75–1–127高抗苗瘟,而金23A和金23B受体亲本均高感苗瘟;共显性标记CoInDF1R2在75–1–127基因组上扩增出大小为354 bp的PCR产物,对金23A或金23B基因组的扩增产物大小约470 bp,说明该标记在2个亲本间的多态性明显且稳定;利用CoInDF1R2开展连续多年MAS回交育种实践,培育出了农艺性状优良、丰产性较好的抗病不育系金23A–Pi9–1及抗病保持系金23B–Pi9–1,为三系法杂种优势利用提供了新的抗稻瘟病亲本材料。

6个抗稻瘟病基因在云南省勐海县水稻主栽品种中的分布

为了明确勐海县水稻主栽品种中已克隆的Pi2、Pi9、Piz-t、Pi50/Pigm、Pita-2和Pib等6抗稻瘟病基因的构成。通过对勐海县18个水稻主栽品种为试验材料,利用6个抗病基因的特异分子标记进行抗瘟基因的分子检测。结果显示:抗性基因Pib分布频率最高,检出率为77.78%,Pi2、Pita-2和Piz-t的检出率分别为22.22%、22.22%和11.11%;在供试品种中未检测出抗性基因Pi9和Pi50/Pigm基因。检测到2个抗性基因和1个抗性基因的品种均为8份(均占44.44%),未检测出抗性基因的品种为2份(占11.11%)。结果表明:勐海县水稻主栽品种的抗性遗传背景较为狭窄,需引入新的有效抗源以拓宽水稻品种的抗病性。

稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因双元载体的构建

为了验证Pi36候选基因的功能,利用长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术从Pi36基因的供体品种Q61中扩增了3个候选基因Pi36-1,Pi36-2,Pi36-3,长度分别为5.9kb,9.6kb和16.5kb,电泳回收目的片段,将Pi36-1和Pi36-2分别克隆到双元载体pCAMBIA1300,而将Pi36-3克隆到双元载体pYLTAC27的AscI位点。为了将Pi36-3也克隆到具有高效转化效率的双元载体pCAMBIA1300中,首先在不改变pCAMBIA1300基本骨架的前提下,在其多克隆位点增加了AscI酶切位点,获得新载体pCAMBIA1300AscI;然后将克隆在载体pYLTAC27上的Pi36-3片段切下来,组装到新载体pCAMBI-A1300AscI上。经过酶切鉴定和测序分析,已成功地获得了3个候选基因的重组阳性克隆,为进一步地研究Pi36基因的功能奠定了基础。

水稻抗稻瘟病基因Pi2的KASP标记开发与应用

【目的】水稻稻瘟病抗性基因Pi2对稻瘟病生理小种具有广谱抗性,开发Pi2的KASP分子标记并对其评价,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用593份自然群体中筛选出的不同抗性和亲缘关系的2份材料H-74和H-78,针对Pi2基因核心区域的SNP位点开发成KASP标记Pi2-C3。【结果】利用标记Pi2-C3对自然群体中的84份材料进行KASP基因分型,结果表明,该标记可以准确地将不同水稻材料的Pi2位点分为抗病基因型、杂合基因型和感病基因型,是一种高效鉴定抗稻瘟病基因Pi2的方法。利用标记Pi2-C3对阳江市病圃材料进行检测,结合表型调查结果发现,检测到含有Pi2基因的46份材料均表现出不同程度的稻瘟病抗性,表明该标记可以用于检测材料在病圃的发病情况。【结论】本研究采用KASP技术,开发了能准确检测Pi2基因的特异性分子标记Pi2-C3,并建立一套水稻Pi2基因的KASP基因分型体系,对提高抗性育种效率,改良抗稻瘟病水稻品种具有重要应用价值。

水稻种质资源稻瘟病抗性全基因组关联分析

稻瘟病是一种对全球水稻生产威胁极大的真菌性病害,鉴定抗稻瘟病基因并将其导入到现有感病品种改良品种的抗性是控制这种病害的有效途径。本研究利用5个稻瘟病菌株鉴定了212份籼稻和235份粳稻种质资源的苗瘟抗性,分别筛选到8个和12个抗全部5个菌株的籼稻和粳稻种质材料。采用全基因组关联分析在籼粳混合群体、籼稻和粳稻种质资源中共定位到43个影响水稻苗瘟抗性的QTL,抗GD00-193、GD08-T19、GD17-CQ16、HB1708和HLJ13-856菌株的QTL分别为9、4、14、14和2个。其中, 12个抗病QTL仅在籼稻亚群中检测到, 7个仅粳稻亚群中检测到,1个为籼粳2个亚群共同检测到,说明籼稻抗稻瘟病总体好于粳稻,而且稻瘟病抗性存在明显的籼粳分化。同时影响水稻对2个及2个以上菌株的抗性或在2个及2个以上群体中同时被定位到的QTL共计11个,利用候选区间关联分析和单倍型分析鉴定到23个抗病候选基因,不同抗病候选基因在籼、粳群体中的分布频率不同。研究结果为水稻品种稻瘟病抗性分子改良提供种质资源和有利基因信息及不同抗病基因的育种利用策略。

常规籼稻品种的稻瘟病抗性基因及穗颈瘟抗性分析

【目的】明确常规籼稻品种资源所携带的稻瘟病抗性基因及抗性效应。【方法】利用PARMS SNP分型技术,检测14个稻瘟病抗性基因在121份常规籼稻品种中的分布情况,并进行田间穗颈瘟自然鉴定,分析基因型和抗性的关系。【结果】大多数供试品种携带2~6个稻瘟病抗性基因,Pi46和Pia的检出率较低,分别为3.3%和7.4%;Pi54和Pi5检出率较高,分别为86.0%和67.8%;所有供试品种均不携带Pi9、Pigm、Pik-m和Pik。田间抗性鉴定结果表明,供试品种的穗颈瘟抗性普遍较弱,但广东品种的穗颈瘟抗性明显好于广西品种的;携带的抗性基因数量与穗颈瘟抗性间相关性不显著;Pi2和Pid3对穗颈瘟抗性贡献显著,优势比值分别为5.98和7.50;Pi2+Pid3+、Pi2+Pi33+和Pid3+Pi33+组合的田间穗颈瘟抗性表现较好。【结论】本研究结果为两广籼稻区稻瘟病抗性基因聚合育种的亲本选择提供了理论支持,为常规稻的合理布局提供了科学参考。

基于PARMS技术的稻瘟病抗性基因分子标记研究及其在江苏太湖稻区的应用

以江苏太湖稻区的206份水稻育种高代稳定材料为研究对象,基于PARMS技术开发并应用了针对抗稻瘟病基因(Pi2、Pib、Pita、Pik)的分子标记,通过对水稻材料的基因型进行鉴定,分析了稻瘟病抗性基因在太湖稻区的分布情况,并进一步探讨了抗性基因与田间诱发穗颈瘟抗病性表现的关系。结果表明,抗性基因Pib、Pita和Pik在供试材料中分布广泛,检出率分别为98.06%、85.44%和40.29%,而Pi2基因的检出率则较低,仅为26.70%。在抗性基因组合中,以“Pib+Pita”组合材料最多,占比84.47%;3个基因组合中以“Pib+Pita+Pik”的材料最多,占比34.47%。由田间抗病性鉴定结果可知,多基因聚合对稻瘟病的抵抗力明显增强,同时存在2个基因“Pib+Pita”的中抗级别以上材料48份,存在3个基因“Pi2+Pita+Pik”的中抗级别以上材料47份。相关性分析表明,Pib和Pik基因与穗颈瘟的抗性呈(极)显著正相关,而Pi2和Pita基因的相关性不显著。本研究结果对于制定江苏太湖地区更有效的稻瘟病防治策略,以及进一步研究抗病品种选育具有重要的理论意义和较大的应用价值。

抗稻瘟病 Pi2/9/z-t 基因特异性分子标记的开发

通过对已克隆的抗稻瘟病基因Pi2、Pi9以及Piz-t进行序列比对,寻找各自特异的核苷酸差异,成功开发了基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9/Piz-t以及Piz-t的基因特异性分子标记,能有效地将Pi2/Pi9/Piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开,这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供有效的分子标记。用Pi2/Pi9/Pizt基因特异性分子标记对来自全国各稻区的共101份水稻品种和育种亲本进行分子检测,结果发现,除2个品种检测到Piz-t带型之外,大部分水稻品种不携带这3个抗性基因,这为有目的地开展品种的抗性改良提供了重要的参考信息。