SARS冠状病毒空斑技术的建立和应用

目的 建立SARS病毒空斑形成试验 ,用于病毒滴定和中和抗体检测。方法 用Vero E6细胞接种6孔塑料细胞培养板 ,加两层含琼脂糖培养基 ,以中性红为染色剂建立空斑试验 ,以能减少 5 0 %的空斑为标准 ,测定抗SARS中和抗体。结果 应用空斑试验能稳定清晰地形成SARS病毒特异性空斑 ,可用于病毒滴定、抗SARS病毒抗体的测定和疫苗效力的检定。结论 为正确滴定病毒、检测中和抗体。

应用空斑减少中和试验法对我国流行性出血热病毒进行血清学分型

应用空斑减少中和试验对分离自不同动物宿主和病人血液的流行性出血热病毒进行病毒抗原性分型,以不同株的家兔免疫血清对国际上血清1型和2型参考毒株进行试验。结果表明,3株来自黑线姬鼠的毒株,其免疫血清对血清1型(76-118株)的效价较血清 2型(UR株)高≥16倍,而6株来自家鼠和大白鼠的毒株中,有5株对2型的血清效价高于1型2～16倍。提示来自黑线姬鼠的毒株符合国际上的血清1型,来自褐家鼠的毒株基本与国际上的血清2型一致,但个别毒株例外。以上结果表明,空斑减少中和试验特异性高,可用于流行性出血热病毒的准确血清学分型。 本文还发现,J10株(分离自锦州市褐家鼠)和HB55诛(分离自河南出血热病人)的血清型与过去文献报道的不符。经反复用不同免疫血清和型特异性单克隆抗体做空斑减少中和试验,均表明这两株病毒的分型与血清1型相同。以上结果为我国首次应用空斑减少试验对我国出血热不同毒株进行准确分型的报道。

MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析

目的:比较MTT分析法、空斑减数试验及细胞病变效应(CPE)观察3种方法在评估药物体外抗病毒效果分析中的优劣,为选择适宜的药物体外抗病毒效果的检测方法提供实验依据。方法:分别采用 CPE法、MTT分析法和空斑减数试验法评价大黄素于体外抗疱疹病毒 1 型、疱疹病毒 2 型和柯萨奇病毒增殖的效果,比较 3 种检测方法的结果,并分析该方法的实用性与利弊。结果:在抗疱疹病毒增殖的检测中,MTT法与空斑减数法所测结果具有显著性差异,空斑减数法比MTT法更准确,但对抗柯萨奇病毒增殖的检测,MTT法与空斑减数法无明显差异。结论:MTT法与 CPE法结合,可广泛用于对抗病毒药物的筛选,但对于疱疹病毒类非杀细胞病毒,使用空斑减数法较好。

SARS病毒BJ01株空斑测定方法的建立

目的 建立SARS病毒空斑测定方法 ,为SARS病毒生物学研究提供手段。方法 将不同稀释度SARS病毒BJ0 1株分别接种Vero细胞单层 ,然后加营养琼盖。按DullbeccoR的方法计算空斑滴度。结果 SARS病毒BJ0 1株加营养琼盖后 ,3天即可出现空斑 ,形态呈圆形 ,直径 2 .5～ 3mm ,大小均匀。结论 建立的SARS病毒的空斑方法稳定 。

甲型流感病毒空斑形成技术的改进和应用

目的改进测定甲型流感病毒株和临床样本病毒滴度的空斑形成方法。方法在12孔板按照不同感染复数（MOI）感染MDCK细胞，覆盖改良营养物（含0．8％琼脂糖，0．005％DEAE，0．2％BSA，1．25μg／ml TPCK），孵育一定时间后固定染色，计算空斑形成单位。以空斑形成法和血凝滴度同时测定感染1～6d后培养液病毒滴度。结果甲1型流感病毒PR8株可形成直径1～3mm的圆形或类圆形空斑，滴度达1×10^7空斑形成单位；临床标本病毒滴度为5×10^3～1．2×10^7PFU／ml；PR8株最佳扩增感染复数为0．01，高峰期为感染后第4天。结论该方法经改进可应用于标准病毒株及临床样本的病毒定量检测和确定流感病毒最佳感染复数；低MOI感染复数易于获得高滴度流感病毒。

空斑法筛选具有中和活性的抗衣原体粘连蛋白McAb

本研究制备了抗１８ｋＤａ粘连蛋白的单克隆抗体，并证实在不同血清型之间，甚至不同种衣原体之间１８ｋＤａ粘连蛋白具有一定的共同抗原表位。我们建立的空斑形成试验和单克隆抗体空斑减少中和试验，实验结果明显、客观，易于判定，稳定性好。用此筛选出县有中和活性的２Ｂ９ＭｃＡｂ。该ＭｃＡｂ不同于目前已报道的ＭｃＡｂ，其中和活性不依赖于补体，而可能是抑制衣原体的粘附。

一种新型的定量测定特异性体液免疫功能的溶血空斑试验

根据补体经典途径激活时，可通过“旁立损伤”机制使邻近正常细胞溶解破坏的原理，该种溶血空斑试验不仅可以用来定量检测分泌ＩｇＭ的抗体形成细胞，也可直接用来定量检测分泌ＩｇＧ的抗体形成细胞。与传统溶血空斑试验相比，其最大的优点是可用来检测机体对任何一种可溶性抗原的特异性体液免疫应答能力，从而扩展了应用范围。

空斑减少中和试验测定血清抗乙脑病毒抗体

目的 对比空斑减少中和试验与反向被动血凝抑制试验在评价人血清抗乙脑病毒抗体时测定结果的异同。方法 对 4 5 0名 6～ 10岁儿童接种灭活乙脑疫苗前后的血清样本用两种方法进行了测定。结果 两种方法在测定免前人血清抗乙脑病毒抗体时存在显著性差异 ,在测定免后人血清抗乙脑病毒抗体时两者没有差异。结论 空斑减少中和试验比反向被动血凝抑制试验在测定人血清抗乙脑病毒抗体时灵敏。

应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性

目的:建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成方法,并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性.方法:将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五种细胞,分别覆盖三种不同的培养物,孵育一定时间后固定染色,比较出斑效果;以新建空斑形成法测定五种细胞感染EV7124-96h后培养液滴度,计算空班形成单位(pfu).结果:在五种细胞中,BGM和VeroE6覆盖琼脂糖凝胶的EV71可形成针尖样空班;覆盖1%甲基纤维素的EV71可形成直径大约1mm圆形或类圆形空班,形成空斑单位最多,病毒滴度分别达2.87×109pfu/L和1.65×109pfu/L;覆盖1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直径大约0.5mm类圆形空斑,在VeroE6细胞中形成针尖样空斑;其他细胞均形成针尖样空斑.结论:空斑形成方法可对肠道病毒进行定量检测,BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞.

噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒检测中的应用

目的:探讨噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒滴度检测中的应用。方法:用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂进行空斑形成实验MDCK和Hep-2细胞在12孔板上形成单层后,分别感染流感病毒和呼吸道合胞病毒,加入单层琼脂糖代替传统双层琼脂糖培养3-4天,用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂计数空斑。结果:⑴MTT法空斑形成实验检测流感病毒和RSV病毒滴度操作简单,时间短;⑵与常规中性红法空斑形成实验比较检测病毒滴度没有差异;⑶MTT法可以避免假空斑形成。结论:MTT法空斑形成实验可替代中性红法空斑形成实验,且更快速、准确。

人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究

目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。

西尼罗病毒空斑形成试验方法的建立与应用

目的建立西尼罗病毒的空斑形成试验方法,应用于病毒滴度测定和实验感染蚊虫及来亨鸡血液样本中病毒的定量检测。方法将稀释的样本接种常规制备的Vero细胞单层,用琼脂糖凝胶覆盖,孵育一定时间后,加中性红染色,计数空斑数,计算空斑形成单位。结果在琼脂糖凝胶中西尼罗病毒可形成直径大约1～3mm的圆形或类圆形空斑。20%病毒鼠脑悬液的病毒滴度为107空斑形成单位。感染蚊虫样本和来亨鸡血液样本也出现典型的空斑。结论建立了西尼罗病毒的空斑形成试验方法,该方法可应用于病毒滴度测定和实验感染蚊虫及来亨鸡血液样本中病毒的定量检测。

草地空斑对种苗建植影响的研究进展

草地空斑(gap)为种苗建植提供了适合的微生境,对种苗建植起着重要作用。介绍了种苗建植和空斑的概念及空斑的功能分类,从空斑对种子萌发、种苗出苗和存活的影响等方面,概述了草地空斑对种苗建植的影响,提出了今后研究的建议,为开展草地空斑和种苗建植研究提供参考。

富硒酵母对小鼠IL-2水平、空斑形成细胞溶血能力及肠道菌群的影响

为研究富硒酵母对小鼠血浆IL-2水平、空斑形成细胞溶血能力及肠道菌群的影响,本试验选用60只清洁级KM小鼠(雌雄各半),随机分为对照组、亚硒酸钠组和富硒酵母组,每日分别灌胃蒸馏水、亚硒酸钠(2μg Se/mL)和富硒酵母(2μg Se/mL)各0.5 mL。试验期为28 d。结果表明,富硒酵母组、亚硒酸钠组小鼠血浆IL-2含量和空斑形成细胞溶血能力的OD413较对照组分别提高18.24%(P<0.01)、17.65%(P<0.05)和12.82%(P<0.01)、7.69%(P<0.05);而富硒酵母组、亚硒酸钠组和对照组小鼠肠道中葡萄球菌、肠球菌、肠杆菌、乳杆菌和双歧杆菌数量均无显著差异(P>0.05)。

草地生态学领域空斑研究进展

空斑(gap)是近几十年来草地生态学领域的重点研究对象之一,在草地植被更新、群落结构和草地生态系统物种多样性维持方面起着重要作用。本文在介绍空斑的概念、功能分类和形成的基础上,总结分析了国内外对空斑的研究现状,发现目前对草地空斑的研究主要集中在空斑大小、空斑类型对物种更新以及空斑对群落结构和物种多样性影响等方面,而对空斑小环境和土壤的研究较少,对空斑内生理生态学、机理和机制性的问题尚缺乏深入探讨;建议在今后加强对空斑内环境变化、空斑内物种的生理生态学特性和物种对空斑更新的响应机制等方面的研究。

SARS-CoV细胞空斑试验

目的建立适用于生物安全三级实验室操作的SARS-CoV空斑试验方法。方法SARS-CoV10倍系列稀释接种Vero-E6细胞,用0.6%琼脂糖覆盖中性红着色(琼脂糖-中性红法)或覆盖1%甲基纤维素,4%甲醛固定,结晶紫染色(甲基纤维素-结晶紫法),空斑计数。结果琼脂糖-中性红法病毒滴度为6.14 Lg pfu/mL,甲基纤维素-结晶紫法病毒滴度为6.57 Lg pfu/mL。结论二种空斑试验方法相比,病毒滴度无明显差异。甲基纤维素-结晶紫空斑试验法形成的空斑比琼脂糖-中性红法清晰、操作简单安全、结果可长期保存。

流行性出血热病毒空斑技术的改进

应用细胞混悬接种法代替单层吸附法改进了空斑技术。两种方法检测的病毒滴度和中和抗体结果均无差异。覆盖物营养层内含适量HEPES对空斑形成有促进作用。血清中和试验时中和作用温度为4℃,同时加适当补体可明显增加中和抗体的滴度。本方法空斑形成所需时间较原方法提前3～4天,试验操作简单,成功率较高,适于推广应用。

呼吸道合胞病毒空斑形成实验的条件优化

采用空斑形成实验方法测定呼吸道合胞病毒（RSV）的滴度,加入覆盖层倒置培养27、30、34、40h后经固定染色、剔除覆盖层后,可见清晰透明空斑,边缘清晰、形态均为圆形或类圆形,空斑直径分别为1、1.5、3、5mm左右。加入覆盖层后培养病毒的时间可以影响RSV最终所形成的空斑大小,并且随着时间的延长空斑逐渐增大,在30～34h所形成的空斑大小最佳,易于计数。病毒的稀释度也会影响空斑最终形成的数量,且随着稀释度的增加,空斑数量逐渐减少。

登革病毒速成甲基纤维素半微量空斑试验的建立

目的：建立一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术。方法：以登革Ⅱ型病毒为代表，对速成法和常规法的实验条件、可靠性、敏感性、重复性等作系统研究。用方差分析和ｔ检验对实验结果进行统计学处理。结果：速成法重复性好，简单快速，敏感稳定，速成法空斑平均水平高于常规法（α１＞α２）。结论：速成甲基纤维素半微量空斑技术是一种可靠易行的病毒空斑新技术，可用于鉴定和滴定病毒，具有较大的实用和推广价值。

有机锗恢复带瘤小鼠溶血空斑的观察

本实验观察了有机锗对带瘤小鼠(ICR/JCL)溶血空斑(PFC)的影响。结果显示,适量的有机锗(10mg/日/鼠)能明显提高带瘤鼠的PFC数(P【0.05),但不能提高正常小鼠的PFC数。说明有机锗对于因肿瘤所致的免疫反应低下具有一定程度的恢复作用。